גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

על מנת לחקור את האינטראקציות של DNA הכרומטין השולטות על ביטוי גנים ספציפי לנוירונים במוח האנושי, יש להשיג תחילה אוכלוסייה טהורה של גרעיני נוירונים. רקמה של מוח אנושי לאחר המוות עוברת הומוגניזציה, וכלל הגרעינים מבודדים באמצעות סנטריפוגציה במדרג צפיפות. לאחר מכן, הגרעינים מסומנים עם נוגדנים ספציפיים לנוירונים ומבודדים באמצעות מיון זרימה (flow metric sorting), ובסוף מרוכזים באמצעות אולטרסנטריפוגה.

שלום, אני אניש מאטן מהמעבדה של ד"ר שרון מקבאריין במחלקה לפסיכיאטריה של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס. היום אראה לכם פרוצדורה לבידוד גרעינים נוירונליים מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. בואו נתחיל.

עבור כל דגימת גרעינים המיועדת למיון, התחילו עם אלף מיליגרם של רקמת מוח קפואה לאחר המוות. מכמות זו ניתן להשיג כ-5 מיליון גרעינים נוירונליים לאחר מיון מופעל פלואורסצנציה. כדי להתחיל את הפקת הגרעינים, העבירו 250 מיליגרם של רקמת מוח לתוך משקפי צנטריפוגה המכילים חמישה מ"ל של לysis buffer, והניחו אותם על קרח.

לאחר הפשרת הרקמה, יש להעבירו למצב של תמיסה (down) למשך דקה אחת על קרח. לאחר מכן, העבירו את הרקמה ההומוגנית לשפופרת אולטרה-צנטריפוגה שקופה בנפח 15 mil והניחו את השפופרת על קרח. חזרו על תהליך הומוגניזציה זה עבור שאר הרקמה.

בשלב הבא, העבירו בזהירות בעזרת פיפט 9 mL של תמיסת סוכרוז לתחתית מבחנות an ultracentrifuge כדי ליצור גרדיאנט ריכוזים, כך שתמיסת הרקמה ההומוגניזית תהיה מעל תמיסת הסוכרוז. כעת שקלו את מבחנות ה-ultracentrifuge כדי להבטיח שהן מאוזנות במהלך ה-ultracentrifugation. בצעו התאמות למשקל על ידי הוספת lysis buffer לשכבה העליונה. לאחר שקילת המבחנות, הכניסו אותן ל-ultracentrifuge תוך שימוש ברוטור SW 28; סבבו את דגימות ה-ultracentrifuge במהירות של 107163.6 RCF למשך 2.5 שעות בטמפרטורה של 4 °C.

עם סיום הסרכזוגציה, שאבו את הנוזל העליון (snat) וכן את שכבת השאריות שנמצאת במדרג הריכוזים. היזהרו לא להפריע למשקע בתחתית המבנה, המכיל את הגרעינים. לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של 1X PBS לכל משקע והשאירו אותו על קרח למשך 20 דקות.

לאחר 20 דקות, השהו שוב את המשקעים על ידי פיפטאג מעלה ומטה. הדגירה על קרח מאפשרת למשקעים להתמוסס מעט באופן עצמאי, מה שמקל על השהיית הגרעינים ובכך מפחית את מידת העקה שהגרעינים חווים. לאחר מכן, העבירו את תמיסת ההשהיה ואת הגרעינים למבחנות צנטריפוגה של 2 מ"ל.

שילובי את תמיסות החומצות הגרעיניות משני צינורות העל-צנטריפוגה לתוך כל צינור מיקרו-צנטריפוגה, והניחו שוב את הדגימות על קרח. כעת, לאחר השלמת מיצוי החומצות הגרעיניות, אעבור לשלב הצביעה האימונוהיסטוכימית במטרה לבודד גרעיני נוירונים באמצעות מיון (FACS); הדגימה המכילה את הגרעינים תודגרה עם תערובת צביעה אימונוהיסטוכימית המורכבת מנוגדן ראשוני ונוגדן משני, וכן מחומרי חסימה. כדי להכין את תערובת הצביעה האימונוהיסטוכימית, הוסיפו 1.2 µL של נוגדן NeuN ספציפי לנוירונים ל-300 µL של 1X PBS. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תערובת חסימה, המכילה 0.5% BSA ו-10% סרום של ארנב נורמלי ב-1X PBS.

לבסוף, הוסיפו מיקרוליטר אחד של הנוגדן המשני הנקרא LOR 4 88. כמו כן, הכינו צביעה אימונוכימית עבור דגימת ביקורת שלילית עבור תערובת צביעה זו. השמיטו את הנוגדן הראשוני והחליפו אותו ב-1.2 מיקרוליטר של 1XPBS.

כעת ערבבו במערבל (vortex) את תערובות הצביעה העקיפה (immunostaining) והדגירו אותן למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך, בזמן שהתערובות נדגרות. הכינו את דגימות הגרעינים לבקרת השלילה על ידי העברה של 20 µL מהגרעינים התוך-מערבבים (resus span nuclei) למסביבב של 2 מ"ל המכיל 980 µL של 1X PBS. הכינו גם בקרת דגימה ללא צביעה, המכילה תמיסת גרעינים ו-PBS בלבד.

כעת העבירו 20 µL של הגרעינים למבחנה אחרת והעלו שוב את הנפח ל-1 mL באמצעות 1X PBS. לאחר מכן, החזירו את כל הדגימות לקרח. בנקודה זו, תערובות הצביעה האימונו-היסטוכימית מוכנות.

במהלך הדגירה, הוסיפו 401 µL מהתערובת לדגימה המתאימה. לדגימת הגרעינים הוספה התערובת המכילה הן את ה-new והן את ה-LOR 4 88. לדגימת הביקורת השלילית הוספה תערובת המכילה רק את הנוגדן המשני LOR 4 88, בעוד ש לדגימת הביקורת ללא צבע לא הוסף צביעת אימונו.

בשלב הבא, העבירו את הדגימות למערכת סיבוב קרה (coldron) וסובבו אותן בחושך למשך 45 דקות. כעת, לאחר שהסתיימה דגירה של 45 דקות, אעביר את הדגימות למעבדה המרכזית לציטומטריה של זרימה (flow cytometry core facility) בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס כדי לבצע מיון מופעל פלואורסצנציה. במהלך ההסעה למעבדה המרכזית, יש לשמור את הדגימות על קרח ובחושך. במעבדה המרכזית לציטומטריה של זרימה, הדגימות מסוננות תחילה דרך מסנן של 40 מיקרון ולאחר מכן הן מועברות במכשיר למשך מספר דקות תוך שמירה על קירור.

פעולה זו מבוצעת כדי לקבל נתונים ראשוניים לפני המיון. הביקורת ללא צביעה קובעת את רמת הפלואורסצנציה השלילית. על בסיס מידע זה, כוון את רגישות המכשיר לפלואורסצנציה.

הבקרה הצבועה משמשת לבקרת פלואורסצנציה. כל רעש רקע הנובע מפליטה פלואורסצנטית בנקודה זו קובע את השערים (gates) המתאימים הנדרשים למיון. מספר שערים שונים משמשים למיון הדגימות.

להלן נתונים טיפוסיים עבור השער הראשון. תרשים ניתוח זה מציג דגימה מייצגת לאחר כיוון השער. השער הראשון מזהה דפוסים של פסולת וגרעינים חיוניים על בסיס שילוב של הגדרות כגון פלואורסצנציה וניסיון חזותי כללי.

ציר ה-x מייצג פיזור קדמי (forward scatter), המתכתב עם הגודל היחסי, בעוד שציר ה-y מייצג פיזור צדי (side scatter), המתכתב עם מורכבות פנימית כגון גרנולריות. השער (gate) הראשון יכול גם לתת מושג על גודלם של הגרעינים השונים שנמצאו בדגימה שלנו. דבר זה מאפשר להפריד את השאריות (debris) מהגרעינים עצמם, וכאן מוצגים נתונים טיפוסיים מהשער השני.

תרשים פקס זה מציג דוגמה לשער (gate) שני, המאפשר למיין גרעינים באופן פרטני תוך השמטת אגרגטים. שער זה בוחן הבדלים בזמני המעבר של הגרעינים דרך הלייזר. אלו המהווים אגרגטים לוקחים בדרך כלל זמן רב יותר כדי לעבור.

פרמטר זה חשוב מאוד, שכן הכללה של אגרגטים עלולה לפגוע בטוהר הדגימה, מכיוון שגרעינים פלואורסצנטיים מסוימים עשויים להיות קשורים לגרעינים שאינם פלואורסצנטיים. לבסוף, להלן נתונים טיפוסיים מהשער השלישי. שער זה מוגדר לאורך גל פלואורסצנציה ספציפי התואם לזה של הפלואורופור שנמצא בנוגדן המשני שלנו.

בדיאגרמה זו, ניתן לראות את רמת הפלואורסצנציה לאורך ציר ה-x וגלאי ערוץ אדום עמוק, PECY seven, לאורך ציר ה-Y. נקודות הבלוט (dot blots) הללו מספקות המחשה ויזואלית טובה יותר בהשוואה להיסטוגרמה של צבע בודד. מיקום SCADA מאפשר למיין ולהפריד גרעיני נוירונים חיוביים מגרעינים לא-נוירוניים שליליים.

לאחר בחירת כל השערים, הגרעינים מומינו לתוך XPBS אחד. לאחר שכל הדגימה עברה את תהליך המיון, יש לבדוק את טוהר המיון על ידי הרצת Eloqua של הדגימה המומינת במכשיר. להלן דוגמה לתוצאה אופטימלית.

כאן השוו את דגימת טרום-המיון, המכילה אוכלוסייה מעורבת של גרעינים, ל-Eloqua הממוין שבו הוסרו רוב הגרעינים השליליים. שימו לב כי אחוזי הטוהר מבוססים על מספר האירועים המזהמים את הדגימה בהתאם לשערים (gates) שהוגדרו. זכרו כי בהרצה הראשונה של הדגימה במכשיר עשוי להתרחש הבהרה (bleaching), מה שגורם לעמעום מסוים; כדי להתחשב בכך, ייתכן שיהיה צורך לבצע התאמות מסוימות.

לאחר מיון הדגימה, התחל בעיבוד הגרעינים. לשם כך, קח 10 mils מהדגימה הממוינת והוסף שני mils של תמיסת סוכרוז, 50 µL של calcium chloride בריכוז one molar, ו-30 µL של magnesium acetate בריכוז one molar. אם יש פחות מ-10 mils של דגימה ממוינת, העלה את הנפח ל-10 mils על ידי הוספת one XPBS או התאם את כמויות החומרים הנוספים בהתאם.

בשלב הבא, הפוך את הדגימה מספר פעמים והנח אותה על קרח למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, סבב את הדגימה בצנטריפוגה עם רוטור של סלי דלי (swing bucket rotor) ב-1,786 RCF למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות. לאחר הצנטריפוגה, שאב בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע הלבן שנמצא בתחתית המבחנה.

לאחר מכן, המיסו את המשקע ב-200 microliters של התמיסה המתאימה הנדרשת לניסויים הקודמים. במקרה זה, אנו ממיסים את המשקע ב-downing buffer עבור ניסוי השבב העוקב. לאחר מכן, השהו שוב את המשקע באמצעות פיפטאז (pipette up and down).

בשלב זה, ניתן להעביר את הגרעינים למבחנה קטנה יותר ולהניח אותה במקפיא של 80°C- . עד לשימוש נוסף, ובכן, הרגע הצגתי בפניכם כיצד לבודד גרעיני נוירונים מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. באמצעות גרעינים אלו, ניתן לבצע מספר ניתוחים שונים, כגון שיקוע חיסוני של כרומטין.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור תמיד את הדגימות על קרח, כיוון שהגרעינים אינם מקובעים ועשויים להתפרק בטמפרטורות גבוהות. כמו כן, חשוב לטפל ברקמה אנושית תחת תקני בטיחות ברמה ביולוגית 2 (biosafety level two) ומעלה. זהו כל הפרוצדורה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.