ה-DNA מפוגל immunoprecipitation

סרטון זה מדגים פרוטוקול להעשרה של DNA מתילציה באמצעות שיקוע חיסוני (methylated DNA immunoprecipitation) או meetup. זוהי שיטה המשמשת לבידוד ספציפי של DNA מתילציה באופן לא מוטה. מתילציה של DNA ביונקים מאופיינת בהוספת קבוצת מתיל לעמדה C5 של ציטוזין.

כאשר היא מופיעה בדינוקלאוטיד CpG, מדובר בסימן אפיגנטי הפיך המשחק תפקיד חשוב בהתפתחות תקינה, כמו גם במספר תהליכים מחלה. תפקודים תקינים של מתילציה של DNA כוללים השתקה של כרומוזום X בנקבות, השתקה של רצפים חוזרים, הטבעה גנומית ושמירה על יציבות גנומית. כמו כן, הוכח כי למתילציה של DNA יש תפקיד במחלות רבות כגון סרטן, תסמונת דה-וילי, תסמונת אנגלמן, ותסמונת של חסר חיסוני, חוסר יציבות בצנטרומר ואנומליות פנימיות.

בסרטנים, למשל, היפרמתילציה חריגה של מקדמים (promoters) עלולה להוביל להשתקת גנים חיוניים למדיקת גידולים. בעוד שהיפומתילציה שגויה גורמת לחוסר יציבות כרומוזומלית ולהפעלה של אונקוגנים, התהליך מבוצע תחילה על ידי סוניקציה של ה-DNA למקטעים שגודלם נע בין 300 ל-1000 זוגות בסיסים. לאחר מכן, ה-DNA שעבר סוניקציה עובר דנטורציה בטמפרטורה של 95 °C.

נוספים נוגדנים ראשוניים, המזהים 5-methazine, והם נשארים להיקשר למקטעי DNA מתילתיים. נוגדנים שניוניים, המשורשריים לחרוזים מגנטיים (dyna beads), משמשים לבידוד מקטעי ה-DNA שנקשרו לנוגדן הראשוני. מקטעים שאינם מתילתיים מוסרים, והנוגדנים מעוכלים באמצעות proteinase.

ניקוי באמצעות כלורופניל פניל KA מסיר את החלבון שעבר עיכול, והשקיעה מטהרת את ה-DNA, המועשר כעת במקטעים מתילתיים. לאחר מכן, ניתן להשתמש ב-DNA ליישומים כגון PCR microarray וריצוף. התהליך מבוצע בדרך כלל כפרוצדורה של יומיים.

היום הראשון כולל הכנת DNA, סוניקציה, שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) ועיכול חלבונים. היום השני כולל מיצוי כלורופורם ב-pH מוגדר ושיקוע אתנול כדי לטהר ולבודד את ה-DNA המועשר במתילציה. נדרשים מספר חומרים מיוחדים לביצוע הפרוטוקול, הכוללים מבחנות צנטריפוגה עם סיליקון, מכשיר סוניקציה ל-DNA, נוגדן ראשוני, נוגדן מונוקלונלי של עכבר נגד 5-methylcytosine, נוגדן שני, כדוריות DynaBeads המשורשרות ל-sheep anti-US IgG, ומעמד מגנטי למבחנות.

השלב הראשון בפרוטוקול The meetup הוא הכנת ה-DNA. חיוני להעריך מראש את טיב ה-DNA. נדרש לדעת מהו מצב ה-DNA של הדגימה, והאם הוא בעיקר דו-גדילי או חד-גדילי, שכן כימות מדויק של הדגימה הוא בעל חשיבות עליונה, ושיטות שונות לקביעת כמות ה-DNA עלולות להיפגע מהנוכחות של סוגי DNA לא רצויים.

ניתן להעריך בקלות את כמות ה-DNA דו-גדילי באמצעות פוטומטריה ספקטרלית באמצעות NanoDrop 3, 300; טען 1.5 µL והגדר את סוג המדידה ל-nucleic acid, בחר ב-DNA 50 כשיטת החישוב ואתחל את המכשיר עם 1.5 µL של מים. נקה את פדסוטי הניסוי ובצע כיול (blank) למכשיר עם 1.5 µL מהנוזל. הדגימה מומסת ב-נקה את פדסוטי הניסוי, טען 1.5 µL מהדגימה ולחץ על measure.

הריכוז יינתן וניתן יהיה להשתמש בו. כדי לחשב את מספר המיקרוליטרים הדרושים עבורי, טבול את A ביחס של 60 עד 80; יחס של 1.8 הוא אידיאלי כאן. דגימה של 1 µg מוכנה.

עם זאת, דגימה של 200 nanograms בלבד מספיקה להשגת תוצאות מוצלחות. להמשך, העבירו את דגימת ה-DNA לשפופרת סיליקונית נקייה. הוסיפו מספיק מים סטריליים כדי להגיע לנפח סופי של 50 microliters.

יש לבצע סוניקציה של DNA ושיקוע חיסוני (immunoprecipitation) במבחנות סליקוניזציה כדי למנוע קישור לא ספציפי של DNA וחלבונים לדפנות המבחנה. לאחר הכנת ה-DNA, יש להעביר את הדגימה לסוניקציה; סוניקציה נדרשת כדי לפרק את ה-DNA, שכן שיקוע חיסוני יעיל יותר עם מקטעי DNA קטנים יותר. טענו את הדגימה למכשיר הסוניקציה, ודאו שהגדרת העוצמה מכוונת ל-high (גבוה), ושהמכשיר מכוון ל-30 שניות הפעלה ו-30 שניות השהיה. מלאו את בסיס המכשיר עד לקו המילוי במים בטמפרטורה של 4 °C.

בצע סוניקציה לדגימה למשך שבע דקות. עם סיום הסוניקציה, הוצא את המבחנה והנח אותה על קרח. חשוב לבצע אופטימיזציה של תנאי הסוניקציה עבור סוג הדגימה וגודל ה-DNA הצפויים מראש.

לדוגמה, דגימת DNA שעברה דגראדציה חלקית תדרוש זמן סוניקציה קצר יותר. ניתן לוודא את תוצרי הסוניקציה באמצעות טכניקות אלקטרופורזה סטנדרטיות. בשלב זה נדרשים מקטעי DNA באורך של 300 עד 1000 base pairs לשימוש מאוחר יותר.

בבדיקות מיקרו-מערכים (microarray) ו-PCR, יש לשמור חמישית מה-DNA שישמש כ-DNA קלט או DNA ייחוס; במקרה זה, 800 nanograms של DNA שעבר סוניקציה ישמשו עבור האימונו-השקעה (immunoprecipitation) והיתרה תופרש כ-DNA ייחוס. השלב הבא בפרוטוקול המדיום הוא תגובת האימונו-השקעה או IP; לפני הוספת הנוגדן הראשוני, יש לדנטור את ה-DNA. דנטורציה נדרשת מאחר שהנוגדן הראשוני רגיש ל-DNA גדיל בודד.

הנח את הדגימה במקלח מים בטמפרטורה של 95 °C למשך 10 דקות. עם סיום שלב הדנטורציה, העבר מיד את המבחנה לקרח למשך חמש דקות לפחות. פעולה זו תמנע מה-DNA שעבר דנטורציה להתרנדנ (reanneal) ותאפשר קישור אופטימלי של הנוגדנים לאחר קירור הדגימה.

סובב את המבחנה קצרות כדי להוריד את התוכן לתחתית. לאחר מכן, יש להוסיף את הנוגדן הראשוני. יש לבצע טיטרציה לכמות הנוגדן שבה נעשה שימוש עבור כל סדרה ועבור כל יצרן.

במקרה זה, אנו מוסיפים 5 µg של נוגדן ראשוני ולאחר מכן מוסיפים תמיסת immunoprecipitation או IP buffer עד לנפח סופי של 500 µL. לאחר מכן, את ה-IP DNA מניחים ברוטטור (rotator) ומדגירים בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים. הסבסוב נדרש כדי למנוע התגבשות של הנוגדנים בתוך המבחנה במהלך הדגירה.

כ-15 דקות לפני סיום דגירה של הנוגדן הראשוני, נקה והכן את חרוזי ה-dyna magnetic beads. ראשית, השהה את החרוזים בבקבוקון באופן יסודי באמצעות וורטקס. לאחר מכן, העבר 30 µL של חרוזים לשפופרת סיליקונית נקייה והנח את השפופרת על מעמד מגנטי עבור תגובות מרובות.

העבירו 30 µL של חרוזיים לכל תגובה, בתוספת כמות למספר תגובה אחת נוספת כדי לפצות על שגיאות פיפטינג או אובדן מקרי של חלק מהחרוזיים. לדוגמה, עבור שמונה תגובות, הסירו כמות של חרוזיים עבור תשע תגובות, שהם 270 µL.

החרוזים המגנטיים יימשכו לעבר דופן הstanch של הrack המגנטי. המתן שתי דקות עד שהחרוזים ינדדו וישקעו למשקע מוגדר על דופן המבחנה. לאחר מכן, הסר והשלך את העל-נוזל (supernatant) באמצעות פיפטה בזהירות, תוך הקפדה לא להפריע לחרוזים על הדופן האחורית עם קצה הפיפטה.

החליפו את הנוזל העליון בנפח עודף של IP buffer, ערבבו במערבל (vortex) והחזירו למסגרת המגנטית למשך שתי דקות. חזרו על שטיפה זו פעם נוספת והשביו את חרוזי השטיפה לנפח המקורי של IP buffer. הוציאו את מבחנת הדגימה מהרוטטור עם סיום הדגירה.

כדי להשלים את האימונו-פרסיפיטציה (שיקוע חיסוני), הוסיפו 30 µL של חרוזי ניקיון לתגובה והחזירו את המבחנה למערבל סיבובי למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 °C. במהלך דגירה זו, הנוגדן המשני, שהוא anti mouse IgG, ייקשר לנוגדן העכבר הראשוני. הנוגדים ה-anti mouse מצומדים לחרוזי dyna מגנטיים, המאפשרים שחזור קל של המוצרים הקשורים ואת שלב הטהרה שבא לאחר מכן.

לאחר השלמת האינקובציה עם שני הנוגדנים, הנח את מבחנת ה-IP על המגנט למשך שתי דקות. בנקודה זו, ה-DNA הממותיל יהיה קשור לנוגדן הראשוני, שבעצמו יהיה קשור לנוגדן המשני המשורשר ל-dyna bead. הסר והשלך את העל-נוזל (supernatant) והחלף אותו ב-500 µL של IP buffer.

ערבבו את תכולת המבחנה והניחו אותה בחזרה על המעמד למשך שתי דקות. חזרו על שטיפה זו עם IP buffer פעם נוספת. לאחר הסרת הנוזל העליון מהשטיפה האחרונה, השביו את החרו지를 למצב של סספנסיות בפעם האחרונה.

ב-400 µL של בופר עיכול, טפל בתגובה באמצעות 100 µg של proteinase K והדגר למשך לילה ב-50 °C. הטיפול ב-proteinase K נחוץ כדי לעכל את חלבוני הנוגדנים וכל חלבון שיורי הקשור ל-DNA, ובכך לאפשר לשחרור ה-DNA המתילטורי אל התמיסה. טיהור ה-DNA מבוצע ביום השני של פרוצדורת המפגש; הוצא את מבחנת העיכול מהמדגרה.

בתוך מ 빠르게 fume hood, הוסיפו למבחנה 500 µL של pheno chloroform ביחס של 1:1 ב-pH 7 וערבלו היטב במכשיר vortex. סבבו את המבחנה במשך 10 דקות ב-13,000 G. הסירו בזהירות את השכבה המימית העליונה מהמבחנה, מבלי להפריע לממשק או להסיר חלק מהשכבה האורגנית. העבירו את השכבה המימית למבחנה חדשה.

ניתן לבצע סבב חילוץ שני אם הממשק נראה עכור. לאחר מכן, הוסיפו נפח השווה למעשר מהנפח של sodium acetate בריכוז 3M, שבמקרה זה הוא 40 µL. ניתן להשתמש ב-1 µL של גליקוגן כנשא כדי להקל על ניקוי המשקע.

ערבב את תוכן המבחנה באמצעות וורטקס. לאחר מכן, הוסף נפח כפול של 100% ethanol, ערבב בוורטקס והקפא במקפיא בטמפרטורה של 20°C- למשך 20 דקות. לאחר ההקפאה, השקע את ה-DNA המשקע בcentrifuge ב-13,000 G ובטמפרטורה של 4°C למשך 20 דקות.

משקע DNA ייווצר בתחתית המבחנה. הוציאו את המבחנה מהצנטריפוגה והסירו את האתנול. היזהרו לא להפריע למשקע בתחתית המבחנה.

ייתכן שיהיה צורך בסבב סרבוב קצר (pulse spin) כדי להסיר שאריות אתנול. כדי לשטוף את המשקע, יש להוסיף 500 µL של אתנול 70% קר, לבצע ערבוב במערבל Vortex, ולסרבב שוב למשך 20 דקות ב-13,000 G ובטמפרטורה של 4 °C. עם סיום הסבב השני, יש לבצע סבב סרבוב קצר להסרת אתנול 70% ולהסיר את שאריות האתנול באמצעות פיפטה.

השאירו את המבחנה על מעמד כאשר הפקק פתוח כדי לייבש את המשקע ולאפשר לאתנול שנותר להתאדות. לבסוף, השביו את המשקע המכיל DNA מועשר במתילציה בלבד ב-10 µL של מים סטריליים, והמתינו זמן מספיק עד להמסה מלאה של משקע ה-DNA לפני השימוש. מומלץ לאמת את יעילות התהליך באמצעות PCR.

ניתן לבצע זאת על ידי הרצת תגובות PCR שנועדו להגביר תוצרים הממחישים באופן דיפרנציאלי מקטעי DNA מתילתיים ובלתי מתילתיים עבור פריימרים המגבירים DNA אנושי נורמלי. ניתן להשתמש באזור הבקרה של ההטבעה (imprinting control region) של H 19 בשילוב עם פריימרים שנועדו להגביר אזור בגנום שאינו מתילתי. דוגמאות לרצפי פריימרים ותנאי מחזוריות PCR ניתן למצוא בפרוטוקול המצורף.

בשלב זה, יש לשלוף את ה-DNA של הקלט או את ה-DNA של הייחוס שהופרשו בתחילת פרוטוקול ה-meetup. סדרה אחת של תגובות PCR תוכנה באמצעות ה-DNA של הקלט, והסדרה השנייה תוכנה באמצעות ה-DNA של ה-IP המועשר במתילציה. אם ה-meetup הצליח, ה-IP PCR ייצב תוצר באמצעות הפריימרים למתילציה, ולא ייצב תוצר באמצעות הפריימרים של הבקרה.

לעומת זאת, ה-PCR של הקלט צריך להפיק תוצרים באמצעות שני הפריימרים, שכן הוא מכיל מקטעי DNA מתילתיים ולא מתילתיים כאחד. DNA המועשר במקטעים מתילתיים יכול לשמש למספר יישומים המשכיים, כגון ריצוף PCR ואנליזת מיקרו-מערך (microarray).

בעת שילוב עם טכניקות אחרות של ביולוגיה מולקולרית, ניתן להשתמש בו לבדיקת מצב המתילציה של DNA באופן ספציפי לאתר או בפריסה גנומית רחבה, לצורך פרופיל מתילציה או חקר האפיגנומיקה.