טכניקה אוסף טורי של הנוזל השדרתי מן צ'יסטרנה מגנה על עכבר
10 בנובמבר 2008
טראנסגנטי (TG) מודלים העכבר לספירה לספק הזדמנות מצוינת לחקור כיצד ומדוע רמות Aβ או טאו בשינוי CSF התקדמות המחלה בחולים אנושיים. כאן, אנו מדגימים מעודן צ'יסטרנה magna טכניקה לנקב הדגימה CSF סדרתי של העכבר.
ההליך מתחיל בהרדמתו של העכבר ובהכנת אתר הניתוח. לאחר מכן, העכבר מונח במצב שכיבה על הבטן על המכשיר הסטריאוטקסי. חריץ סגיטלי בעור בוצע נחית לעורף, והרקמה התת-עורית ושרירי הצוואר הופרדו בעזרת הפרדה קהה לאורך קו האמצע.
לאחר מכן, החלק האחורי של הגוף מונח כך שהגוף יוצר זווית של 135 מעלות ביחס לראש המקובע, הקפסולה של ה-cisterna magna נחודרת באמצעות הנימי זכוכית ונוזל ה-CSF נאסף. לאחר דגימת ה-CSF, השרירים מוחזרים למקומם והעור נתפר; כ-1 מיליליטר של תמיסת NaCl 0.9% מוזרקת תת-עורית כדי למנוע התייבשות, והעכבר נשמר בחום עד להחלמתו. שלום, שמי ליו מהמעבדה של ד"ר קארן דאף במכון The Top של אוניברסיטת קולומביה.
היום אראה לכם כיצד לאסוף נוזל חוט שדרה (CSF) מה-cisterna magna של העכבר. באמצעות טכניקה זו, ניתן לאסוף דגימות CSF סדרתיות עד שלוש פעמים מאותו עכבר, במרווחים של חודשיים עד שלושה חודשים. במעבדה שלנו, אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לקבוע את רמות ה-A beta או ה-tau ב-CSF בגילאים שונים של מודלים טרנסגניים של עכברים למחלת אלצהיימר, ואנו מקיימים קורלציה בין ערכים אלו לבין ערכים במוח.
לבסוף, אנו מעוניינים לבחון את הפוטנציאל של רמות beta או tau ב-CSFA כסממנים ביולוגיים פוטנציאליים להתקדמות המחלה וכן עבור ניסויים טיפוליים בעכברים. אם כן, נתחיל. לצורך הליך זה, יש להכין קפילרות באמצעות מיקרו-פיפט פולארי.
הנימים שנעשה בהם שימוש כאן הם BOA silicate glass B 175 10 מבית Sutter Instruments; יש למשוך את הנימים באמצעות Sutter P 87 flaming micro pipette polar כאשר מדד החום (heat index) מוגדר על 300 ומדד הלחץ (pressure index) מוגדר על 30. הנימה מזכוכית היא באורך של 5 cm ובעלת קצה מדחף. קצה הנימה נגזז במספריים כך שקוטרה הפנימי הוא כ-0.5 mm.
ההליך הכירורגי מתחיל בהרדמת העכבר באמצעות ketamine במינון 100 milligrams per kilogram ו-xylazine במינון 10 milligrams per kilogram הניתנים בזרקה תוך-בטנית (intraperitoneal); במהלך ההרדמה, יש לשמור על חום גוף העכבר בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius. לאחר קביעה כי בעל החיים מורדם לחלוטין באמצעות בדיקת רפלקס נסיגה למעיכה של בהונות, יש לגלח את הצוואר, ולאחר מכן להניח את העכבר על מכשיר סטריאוטקסי, כגון זה של David kink. במגע ישיר עם פד החימום, יש להחדיר חיישן טמפרטורה רקטלי כדי שניתן יהיה להתאים את החום של הפד בהתאם לטמפרטורת גופו של העכבר.
ייצב את הראש באמצעות מתאמי הראש, נקה את עור הצוואר עם 10%povidone iodine ו-70%ethanol שלוש פעמים ובצע חתך שגגי (sagittal) נמוך מהחלק האחורי של הראש או העורף (occiput). את השלבים הבאים יש לבצע תחת מיקרוסקופ ניתוח באמצעות פינצטה רחבה (blunt forceps). הפר את הרקמה התת-עורית ואת השרירים M by ventor services ו-M rectus capita dorsalis major כך שקרום העטיפה (dura mater) של ה-sternum magna ייחשף. השתמש כראוי בזוג רטראקטורים מיקרוסקופיים כדי להפריד את השרירים.
לבסוף, הנח את העכבר כך שהראש יהיה בזווית של 135 מעלות לגוף. העכבר מוכן כעת לאיסוף CSF. טכניקה זו לאיסוף CSF מה-cisterna magna פורסמה בעבר.
איור 1C תחת מיקרוסקופ דיסקציה. הקרומי הדורה (dura mater) נראה כמשולש הפוך, מבריק ושקוף, שדרכו נראים המוח המוארך וכלי דם ראשי. Arteria dural spinella איור 1B. ניתן להבחין בדופק המחזורי של המוח המוארך ובחלל ה-CSF הסמוך.
ייבשו את הקרומי העמוקים (dura matter) באמצעות מקלון צמר סטרילי, והחדירו את הנימיון אל ה-CI sternum magna דרך הקרומי העמוקים, לטרלית ל-arteria dorsalis spinels. יורגש שינוי ניכר בהתנגדות כאשר הנימיון מוחדר נכון, ואז יזרום נוזל חוט השדרה (CSF) אל תוך הנימיון. לאחר איסוף ה-CSF, הוציאו בזהירות את הנימיון וחברו אותו למזרק של 3 mL באמצעות צינור פוליאתילן בעל קוטר פנימי של 1 mm.
הזריק את ה-CSF למבחנה של 0.5 milliliter. סמן את המבחנה והקפא אותה מיד על קרח יבש. לאחר ההקפאה, העבר את ה-CSF למקפיא של minus 80 degree Celsius.
טכניקת הדגימה שהודגמה כעת היא עדינה ביותר ומאפשרת נטילת דגימות CSF עוקבות מאותה עכבר לאורך מרווח של חודשיים עד שלושה חודשים. לפיכך, לאחר הדגימה מהצוואר, יש לסדר מחדש את השרירים והעור ולסגור אותם באמצעות תפרים. לאחר תפירת החתך, הזרק כ-1 milliliter של תמיסת סלין 0.9%NACL תת-עורית כדי להחזיר נוזלים לעכבר.
שמרו על העכבר מחומם בטמפרטורה של כ-37 °C עד להחלמתו. עקבו אחר משקלו ביום הראשון וביום השביעי לאחר הניתוח. כעת הדגמתי בפניכם כיצד לאסוף נוזל חוט שדרה (CSF) מהמערכת של העכבר.
בעת ביצוע הליך זה, יש לזכור שלושה דברים חשובים. ראשית, יש למקם את ראשו וגופו של העכבר כראוי על המסגרת הסטריאוטקטית, כך שחלקו של ה-Cy Magna יהיה חשוף ככל האפשר. שנית, יש להימנע בזהירות מכלי דם בעת חדירה אל ה-durometer באמצעות קפילרה.
אחרת, הדגימה שלכם תזדהם על ידי הדם. אחרון חביב, אנא זכרו לשמור על העכברים שלכם חמימים במהלך כל ההליך כדי למנוע היפותרמיה. היפותרמיה אינה רק מזיקה לעכברים שלכם, אלא היא יכולה להשפיע באופן משמעותי על התוצאות על ידי השראת ייצור beta או קשר של tall hypo phosphorylation.
ובכן, זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקה משופרת לדגימה סדרתית של נוזל חוט השדרה (CSF) ממודלים טרנסגניים של עכברים למחלת אלצהיימר (AD). השיטה מאפשרת הבנה טובה יותר של השינויים ברמות Aβ או tau ב-CSF עם התקדמות המחלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- מחקר על מחלת אלצהיימר
- מודלים של עכברים טרנסגניים
רקע
- מודלים של עכברים טרנסגניים הם בעלי ערך לחקר מחלת האלצהיימר.
- רמות של Aβ ו-tau בנוזל ה-CSF הן סממנים ביולוגיים קריטיים להתקדמות AD.
- הבנת שינויים אלו יכולה להנחות אסטרטגיות טיפוליות.
- שיטות נוכחיות לדגימה של CSF עשויות להזדקק לדיוק משופר.
מטרת המחקר
- להדגמת טכניקה משופרת לדגימת CSF בעכברים.
- להקל על ביצוע מחקרים אורך של ביומרקרים של AD.
- לשיפור אמינות ניתוח ה-CSF במודלים טרנסגניים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרדמה של העכבר לפני הפרוצדורה.
- הכנה כירורגית הכוללת חיתוך של העור והפרדת השרירים.
- שימוש בקפילרית זכוכית לחדירה דרך הקרומים העוטפים את השפיקים (dura mater) לצורך איסוף CSF.
- טיפול לאחר הדגימה הכולל תפירה ותמיכה בהידרטציה.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה המשופרת מאפשרת דגימה יעילה של CSF.
- דיוק משופר במדידת רמות Aβ ו-tau.
- מקל על דגימה חוזרת למחקרים אורכיים.
- משפר את ההבנה של התקדמות AD במודלים של עכברים.
מסקנות
- טכניקת הדקירה המשופרת היא כלי בעל ערך למחקר של AD.
- היא מאפשרת ניטור טוב יותר של סממנים ביולוגיים ב-CSF לאורך זמן.
- שיטה זו עשויה להוביל לתובנות משופרות לגבי מנגנוני מחלת אלצהיימר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
איסוף סדרתי של נוזל ברחורי השדרה (CSF) מה-cisterna magna במודלים של עכברים מאפשר מעקב ארוך טווח אחר סמנים ביולוגיים, דבר הקריטי למחקר על מחלת אלצהיימר (AD). טכניקה מזוקקת זו מצמצמת את השונות בין בעלי החיים, ובכך תומכת ברמת ביטחון ניבויית גבוהה יותר במחקרי סמנים ביולוגיים תרגומיים. גישה זו מחזקת את הגילוי המוקדם ואת קבלת ההחלטות בשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת הערכה כמותית חוזרת של הדינמיקה של Aβ ו-tau במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנוני מחלה על ידי מעקב אחר שינויים ב-Aβ וב-tau בנוזל החוטra (CSF) לאורך זמן במודלים טרנסגניים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי קורלציה בין רמות של סממנים ביולוגיים ב-CSF לבין פתולוגיה מוחית.
- מסייע בביטחון ניבוי בבחירת סממנים ביולוגיים למחקרי התקדמות של AD.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק דגימות CSF מאומתות לבדיקות ELISA ובדיקות כמותיות המשך.
- משפר את הדירות של הבדיקה על ידי מתן אפשרות לדגימה סדרתית מאותו בעל חיים.
- מאפשר הערכה מהימנה של התערבויות טיפוליות על פרופילי סמנים ביולוגיים ב-CSF.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים בין שינויים בביומארקרים של ה-CSF לבין התקדמות המחלה במודלים פרה-קליניים של AD.
- תומך ברצף תרגומי על ידי אפשור השוואה ישירה בין נקודות סיום ב-CSF וברקמת מוח.
- מפחית סיכונים בקבלת החלטות על קידום מועמדים טיפוליים המונעות על ידי ביומארקרים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
טכניקה זו משתלבת ברצף של תהליכי הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת דגימה חוזרת ופולשנית באופן מינימלי של CSF לצורך ניתוח ביומרקרים במודלים של עכברים לניוון עצבי.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות לגבי דינמיקה של סמנים ביולוגיים ומסלולים מכניסטיים במודלים של AD.
- סריקה: מספק דגימות CSF כמותיות וסטנדרטיות לפיתוח בדיקות ולהערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מערכי נתונים אורכיים להשוואה סטטיסטית של מסלולי סמנים ביולוגיים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים של סמנים ביולוגיים בשלב הפרה-קליני לבין פירוש נתוני CSF אנושיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לאיסוף סדרתי של CSF במודלים של מחלות ניוורו-דגנרטיביות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במחקרים מונחי סמנים ביולוגיים ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של איסוף CSF, שיפור השחזוריות ותמיכה במחקרים ארוכי טווח שניתן להרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקה (go/no-go) של תיקוף סמנים ביולוגיים ומחקרים של התערבויות טיפוליות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של יעדים ל-AD וטיפולים מועמדים מותאם סיכונים, בהתבסס על נתונים חסונים של סמנים ביולוגיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות טכנית במיקרו-כירורגיה ובטיפול בבעלי חיים.
- נדרשת גישה למכשור סטריאוטקסי, למשכי מיקרו-קפילריות (microcapillary pullers) ולפלטפורמות ELISA.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים כדי להבטיח את שלמות הדגימות ואת הדיוק במחזוריות התוצאות.
- ניתן להתאימה למודלים שונים של עכברים טרנסגניים, תוך שימת לב לניואנסים אנטומיים ופרוצדורליים.
- הימנעות קפדנית מזיהום של הדגימות בדם ושמירה על רווחת בעלי החיים הן קריטיות לקבלת תוצאות תקפות.
