Articolo metodologico

Isolamento delle sottopopolazioni subcellulari di ribosomi basato su biotinilazione potenziata da illuminazione limitata da tag peptidico ricombinante specifico per peptidi

DOI:

10.3791/66881

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24 luglio 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Stanford School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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La Biotinilazione potenziata per illuminazione limitata a posizione specifica AviTag (ALIBi) è un nuovo metodo optogeneticamente attivato sviluppato per il marcatore e la purificazione di affinità delle popolazioni subcellulari di ribosomi per sequenziamento a valle e analisi proteomiche.

Abstract

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Crescenti evidenze suggeriscono che la traduzione dell'mRNA è un processo altamente compartimentalizzato all'interno di una cellula, e che il traffico subcellulare e la localizzazione di specifici mRNA sono fondamentali per garantire che proteine con funzioni specifiche per compartimento vengano prodotte nell'ambiente ideale e in quantità adeguate. Tuttavia, le tecniche per l'isolamento subcellulare e la caratterizzazione dei ribosomi che traducono questi mRNA sono state finora limitate, tanto che molto non è ancora presente su come la composizione dei meccanismi traslazionali contribuisca alla regolazione della traduzione localizzata dell'mRNA.

Qui dimostriamo la Biotinilazione Potenziata da Illuminazione Limitata a Posizione (ALIBi) specifica per AviTag, un metodo che combina il marcatore degli epitopi, una nuova ligasi a biotina divisa attivata optogeneticamente e la purificazione di affinità per etichettare e isolare rapidamente e specificamente i ribosomi localizzati in qualsiasi compartimento subcellulare di interesse. Innanzitutto, il montaggio CRISPR/Cas9 viene utilizzato per fondere un peptide AviTag, un sito di scindimento proteasi del virus del tabacco etch virus (TEV) e un tag epitopico FLAG a una proteina ribosomica. La legasi di biotina spezzata, fusa a un dominio di mira agli organelli, è espressa in questa linea cellulare ed è inattiva sotto concentrazioni normali di biotina. Attivata tramite biotina supplementare e illuminazione con luce blu, la ligasi biotinilata ribosomi AviTagged nelle immediate vicinanze, permettendo la purificazione di affinità dei ribosomi biotinilati e delle proteine e mRNA associati su perle rivestite di streptavidina. L'eluzione non denaturante tramite la clivatura della proteasi TEV fornisce campioni adatti per la caratterizzazione a valle di proteine ribosomiche centrali, proteine associate al ribosoma e mRNA legati ai ribosomi tramite sequenziamento RNA o proteomica di spettrometria di massa.

In questo protocollo, rivediamo i principi di progettazione per fondere AviTag con una proteina ribosomica e indirizzare l'enzima ligasi della biotina divisa all'organello di interesse. Dimostriamo l'attivazione del sistema ALIBi, la lisi cellulare, la purificazione dell'affinità e l'eluzione del campione. Infine, discutiamo i risultati tipici e la risoluzione dei problemi.

Introduzione

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È importante necessità di strumenti che possano isolare campioni biologici da specifici compartimenti subcellulari per indagare meglio come l'organizzazione e il traffico subcellulari influiscono nei processi cellulari. La traduzione dell'mRNA è un esempio chiave di tale processo: crescenti evidenze suggeriscono che la traduzione è altamente compartimentata e, in particolare, che molti mRNA sono localizzati negli organelli dove risiederanno le loro proteinecodificate 1,2. Tuttavia, si sa meno sulla localizzazione subcellulare dei meccanismi traslazionali. I ribosomi iniziano la loro esistenza nel nucleolo e nel nucleo, dove inizia l'assemblaggio delle proteine ribosomiche (RP) e degli RNA ribosomiche (rRNA). Vengono poi esportati nel citoplasma per le fasi finali di assemblaggio, dopodiché iniziano a tradurre glimRNA 3,4. I siti canonici di traduzione includono il citoplasma e il reticolo endoplasmatico; quest'ultimo è il luogo in cui le proteine integrali della membrana e le proteine destinate a organelli legati alla membrana o alla secrezione extracellularevengono sintetizzate 5. I siti di traduzione localizzata più recentemente identificati includono i mitocondri, il perossisoma e i processineuronali 6,7,8,9,10,11,12. È interessante notare che stanno emergendo anche prove che caratteristiche del meccanismo traslazionale come proteine associate ai ribosomi, modifiche post-traduzionali, modifiche dell'rRNA e stechiometria non canonica delle proteine ribosomiche centrali siano coinvolte nei meccanismi regolatori che regolano la traduzione di specifici mRNA e parametri come la fedeltà e la velocitàdi traduzione 13,14,15,16,17.18, 19, 20. Ad esempio, sono state identificate centinaia di proteine che interagiscono con il ribosoma e potrebbero potenzialmente portare a differenze nella composizione subcellulare delribosoma 13. Tuttavia, le tecniche per isolare popolazioni di ribosomi subcellulari sono state finora limitate; pertanto, molto rimane sconosciuto su come la composizione dei meccanismi traslazionali contribuisca a regolare la traduzione localizzata dell'mRNA. L'avvento di metodi versatili per isolare le popolazioni di ribosomi subcellulari, in particolare quelle compatibili con i sistemi modello di mammiferi, permetterà di esplorare queste caratteristiche della macchina di traduzione a livello subcellulare.

I primi metodi per isolare frazioni subcellulari contenenti ribosomi si basavano sui principi della lisi sequenziale e dellacentrifugazione 21,22. Tipicamente, questi metodi sono limitati a determinati organelli e spesso richiedono lunghi tempi di lavorazione. Un metodo più recente si basa sulla biotina ligasi BirA, che biotinila specificamente un substrato peptidicoAviTag 10,23,24. Il BirA può essere localizzato geneticamente all'organello di interesse nelle cellule in cui i ribosomi sono stati marcati con AviTag. Tuttavia, poiché BirA è attiva a concentrazioni fisiologiche di biotina, è necessario coltivare cellule in condizioni di esaurimento della biotina per evitare la biotinilazione costitutiva e non specifica dei ribosomi portantiAviTag 10,24. Questo limita l'uso di BirA nei tipi cellulari sensibili alla depurtazione dellabiotina 25. Infine, sono stati sviluppati metodi di biotinilazione promiscua che utilizzano enzimi ingegnerizzati come BioID, TurboID eAPEX 26,27,28. All'induzione, questi enzimi producono un intermedio biotinico reattivo che modifica covalentemente eventuali residui di lisina entro un raggio dell'enzima. I metodi di biotinilazione promiscua sono molto utili per mappare i proteomi subcellulari, ma meno informativi per distinguere proteine nelle vicinanze generali dei ribosomi localizzati rispetto a proteine più vicine a essi.

Qui dimostriamo il nostro metodo recentemente sviluppato per etichettare e isolare le popolazioni di ribosomi subcellulari, chiamato Biotinilazione potenziata da illuminazione limitata a posizione specifica AviTag (ALIBi). Questo metodo sfrutta un BirA split ingegnerizzato fuso a interruttori magneti (eMag) potenziati optogeneticamente (Figura 1A) che si eterodimerizzano sotto illuminazione a luceblu 29; e un tag peptidico costituito da epitopo FLAG, sito di clivagatura proteasi del virus dell'incisione del tabacco (TEV) e AviTag (FTA) fuso alla proteina ribosomica Rpl31 (Figura 1B). L'enzima diviso può essere geneticamente indirizzato a organi selezionati, è inattivo a concentrazioni fisiologiche di biotina e può essere ricostituito in pochi minuti con illuminazione alla luce blu e aggiunta di biotina supplementare (Figura 1C-E). La successiva lisi cellulare, la purificazione di affinità e l'eluzione enzimatica non denaturante tramite la clivatura della proteasi TEV producono ribosomi e molecole co-purificanti come mRNA e proteine associate ai ribosomi, adatte a metodi analitici a valle come il sequenziamento dell'RNA e la proteomica della spettrometria di massa (Figura 1A). Pertanto, questo metodo rivela non solo la composizione dei ribosomi ma anche gli mRNA a cui i ribosomi sono legati. In un recente articolo che descrive l'applicazione fondamentale di ALIBi per caratterizzare le popolazioni di ribosomi subcellulari, abbiamo indirizzato con successo l'enzima diviso al citoplasma, nucleolo, nucleo, reticolo endoplasmatico, membrana plasmatica e mitocondri (Tabella 1)30. Il confronto risultante dei meccanismi traslazionali tra questi compartimenti subcellulari portò a nuove e inaspettate scoperte riguardo alla traduzione nel reticolo endoplasmatico e nei mitocondri, oltre a potenziali piste per future indagini sui fattori della biogenesi ribosomica nel nucleo e nel nucleolo.

Questo protocollo contiene una dimostrazione dettagliata della trasfezione e attivazione del sistema ALIBi, della lisi cellulare, della purificazione dell'affinità e dell'eluzione del campione. Discutiamo anche come verificare una purificazione di affinità efficace tramite western blot e formuliamo raccomandazioni per eseguire sequenziamento a valle dell'RNA o analisi proteomica della spettrometria di massa (MS) (vedi Supplemental File 1). Questo protocollo è stato scritto per esperimenti che utilizzano cellule staminali embrionali di topo (mESC) che esprimono Rpl31 fuso alla FTA (L31-FTA) in modo omozigino dal loco endogeno Rpl31; Questa linea cellulare è disponibile dagli autori su richiesta. La strategia per generare questa linea cellulare è descritta nel File Supplementare 1 e nella Figura Supplementare S1 e nella Figura Supplementare S2. Plasmidi che codificano gli enzimi divisi destinati a diversi organelli sono disponibili su Addgene (numeri di catalogo #235608 a 235643). I principi di progettazione per indirizzare gli enzimi divisi a questi organelli sono descritti nel Supplemental File 1. Il protocollo presume che ogni campione provenga da mESC coltivati su una piastra da 10 cm. Abbiamo riscontrato che la scala a 10 cm fornisce materiale sufficiente per la proteomica della spettrometria di massa, mentre la scala a 6 pozzi è sufficiente per i western blot o il sequenziamento dell'RNA.

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Protocollo

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1. coltura cellulare mESC

NOTA: Prima dell'attivazione di ALIBi e della lisi cellulare, le mESC devono essere trattate con la tecnica standard sterile per la coltura cellulare. La centrifugazione dei mESC intatti dovrebbe essere eseguita a 200 × g per 3 minuti a temperatura ambiente, salvo diversa specificazione. Preriscaldare il substrato a 37 °C in un bagno-maria prima dell'uso, salvo diversa specificazione. Le mESC devono essere inserite in una piastra di coltura tissutale fresca che è stata gelatinizzata durante la notte (vedi passo 1.1).

  1. Il giorno prima dello scongelamento dei mESC L31-FTA, ricoprire il fondo di una lastra da 10 cm con 5 mL di gelatina allo 0,1%. Incubare a 37 °C durante la notte.
  2. Combinare i componenti del mezzo mESC (Tabella 2) e passare attraverso un filtro da 0,2 μm. Conserva a 4 °C per un massimo di 1 mese.
  3. Il giorno dello scongelamento, riscalda un'aliquota da 5 mL di substrato per diluire le celle scongelate e un'aliquota da 10 mL per la placcazione.
  4. Recupera un cryovial contenente ~5 × 106 MESC L31-FTA dall'accumulo di azoto liquido. Scongela immediatamente facendo roteare il fondo della fiala in un bagno d'acqua a 37 °C.
  5. Mescolare delicatamente 0,5–1 mL di substrato dall'aliquota da 5 mL con il contenuto crioviale a seconda della capacità della fiala, quindi trasferire il contenuto del criovo all'aliquota da 5 mL.
  6. Granula le celle tramite centrifugazione. Aspira il soprandante.
  7. Risospendi il pellet cellulare con l'aliquota da 10 mL.
  8. Aspirare la gelatina dalla piastra da 10 cm e trasferire immediatamente la sospensione cellulare nella placca. Incubare a 37 °C.
  9. Ogni 24 ore (tranne nei giorni di passaggio di lettura), aspira il substrato vecchio dalla placca e sostituisci con 10 mL di substrato fresco.
  10. Quando le colonie sono confluenti per il 70%–80% (tipicamente 48 ore dopo la placcatura), aspirare il substrato vecchio e risciacquare due volte con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco.
  11. Dopo aver aspirato il DPBS, ricoprire la piastra con 2 mL di tripsina allo 0,05% (Tabella 2). Incubare a 37 °C per 5 minuti.
  12. Neutralizza la tripsina aggiungendo 4 mL di mezzo mESC freddo alla placca. Usa immediatamente una pipetta sierologica da 5 o 10 mL per pipettare su e giù 15 volte nella placca per dissocere le colonie in una sospensione monocellulare.
  13. Trasferisci la sospensione in un tubo conico. Opzionalmente, rimuovere un'aliquota per contare le cellule usando un emocitometro.
  14. Granula le celle tramite centrifugazione. Aspira il soprandante.
  15. Sospendere la pellet cellulare in un substrato fresco. La piastra 5 × 106cellule (tipicamente rapporto di passaggio 1:6) in una piastra fresca gelatinizzata di 10 cm e incubare a 37 °C. Ripetere i passaggi 1.9–1.15 secondo necessità fino a quando non è pronto per procedere con la trasfezione.
  16. Per produrre stock cellulari congelati, tripsinizzare una piastra di mESC (come nei passaggi 1.10–1.14). Risospendere il pellet cellulare in mezzo congelante (250–500 μL per 5 × 106 cellule), aliquotare in crioviali e congelare lentamente in un contenitore di congelamento cellulare a -80 °C durante la notte prima di trasferirlo nello stoccaggio di azoto liquido.

2. Trasfezione

NOTA: Esegui la trasfezione in un giorno in cui i mESC sono pronti per il passaggio. I plasmidi possono iniziare a esprimersi già 3-5 ore dopo la trasfezione. Una volta espresse, raccomandiamo di maneggiare le cellule al buio e minimizzare l'esposizione a temperature inferiori a 37 °C per prevenire l'attivazione prematura, poiché lavori precedenti hanno dimostrato che i domini optogenetici magnetici si dimerizzano non solo sotto illuminazione blu ma anche durante l'esposizione alfreddo 31. Tieni i piatti in un incubatore dedicato o proteggi una mensola in un incubatore condiviso dalla luce con carta stagnola. Quando maneggi celle all'esterno dell'incubatrice, spegni o blocca tutte le luci e finestre della stanza in anticipo e usa una lampada frontale a luce rossa per vedere. Non lasciare la porta dell'incubatrice aperta più a lungo del necessario. Estrai solo piccoli gruppi di piastre dall'incubatrice alla volta e appoggia le piastre su una superficie isolante (cioè un coperchio pulito in polistirolo) mentre le manipolli per minimizzare il contatto con superfici di lavoro a temperatura ambiente. Riscalda completamente il materiale prima dell'uso. Non ispezionare le lastre al microscopio a emissione di luce.

  1. Il giorno prima della trasfezione, gelatinizza una piastra da 10 cm.
  2. Il giorno della trasfezione, aspira la gelatina dalla piastra e aggiungi 7,5 mL di substrato per preriscaldare a 37 °C. Preriscaldare il mezzo sirico ridotto a 37 °C per le cellule in risospensione.
  3. Diluire 18,75 μL del reagente di trasfezione in 250 μL di mezzo siero riddotto. Batti delicatamente per mescolare e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  4. Se si co-esprimono due plasmidi che codificano i frammenti N e C, aggiungere 3,75 μg di ciascun plasmide a 250 μL di mezzo siero ridotto. Se si esprime solo un plasmide (cioè un controllo negativo GFP o un controllo positivo BirA a lunghezza completa), si aggiungono invece 7,5 μg del singolo plasmide.
  5. Aggiungi la miscela plasmide/medium siero ridotto alla miscela di reagente per trasfezione/substrato siero ridotto e poi incidi/inverti per mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
  6. Nel frattempo, tripsinizzare e mettere in pellet i mESC (passaggi 1.10–1.14). Risospendere il pellet in un mezzo siero ridotto riscaldato a una concentrazione di 10 × 106 cellule/mL.
  7. Aggiungere 7,5 × 10cellule sospense da 6 (750 μL) alla miscela plasmide/reagente per trasfezione/mezzo siero ridotto. Inverti il tubo per mescolare. Incubare per 10 minuti a RT, invertendo occasionalmente i tubi per mantenere le cellule sospese.
  8. Inverti di nuovo i tubi brevemente e aggiungi la miscela mESC/plasmide/reagente per la trasfezione/mezzo siero ridotto alla piastra contenente il mezzo riscaldato. Dondola delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le cellule.
  9. Incubare la piastra a 37 °C per 3–5 ore, permettendo alle cellule di aderire entro questo tempo.
    NOTA: Da questo momento in poi, raccomandiamo di osservare le precauzioni sopra indicate contro l'esposizione alla luce e temperature inferiori a 37 °C.
  10. Aspira delicatamente i vecchi media. Aggiungi un substrato fresco riscaldato, pipettando lungo il lato della piastra per evitare che le cellule si stacchino. Riprendere l'incubazione a 37 °C.
  11. Se si attiva/lisa a 24 ore dopo la trasfezione, procedere alla sezione 3. Se si pianifica di attivare/lisare 48 ore dopo la trasfezione, cambiare substrato ~24 ore dopo aver placcato le cellule trasfecate.

3. Attivazione di ALIBi e lisi cellulare

NOTA: Continuare a maneggiare cellule/campioni al buio fino all'inizio dell'eluzione (passo 5.4). Una volta che le cellule sono state raffreddate su ghiaccio (passo 3.15), mantenere i campioni freddi e utilizzare solo reagenti raffreddati fino all'inizio dell'eluzione. Assicurati che superfici di lavoro, attrezzature, reagenti e plastiche siano privi di RNAsi utilizzando oggetti appena aperti e pulendo o risciacquando superfici dure con una soluzione decontaminante a RNAse e etanolo al 70%. Indossa i guanti ogni volta che manipoli campioni o attrezzature. Per i campioni destinati alla proteomica della SM, si minimizza anche la contaminazione da cheratina mantenendo lo spazio di lavoro libero da polvere; Coprire la pelle nuda e legare i capelli lunghi.

  1. Preraffredda la centrifuga a 4 °C.
  2. Con le luci spente, sposta le piastre trasfettate in un incubatore temporaneo a 37 °C in modo che non vengano esposte a fluttuazioni di temperatura nell'incubatrice principale dopo che il transilluminatore è stato posizionato all'interno.
  3. Pulisci il transilluminatore a luce blu con etanolo al 70% e collegalo alla corrente. Posizionare il transilluminatore nell'incubatore principale e lasciare che le condizioni dell'incubatore si riequilibrino continuando con l'allestimento.
  4. Riscaldare un'aliquota di substrato da dosare con biotina e cicloesimide (CHX) (10 mL di substrato per piastra da 10 cm) a 37 °C. Se si fanno epru di controllo senza biotina supplementare, riscaldare anche un aliquota separato da somministrare solo con CHX.
    NOTA: Alcuni componenti del tampone possono essere miscelati il giorno prima dell'uso e conservati durante la notte a 4 °C (vedi Tabella 2). Si noti che diverse ricette di lisi e wash buffer sono state utilizzate per esperimenti destinati alla proteomica western blot o MS e per quelli destinati al sequenziamento dell'RNA.
  5. Raffreddare un'aliquota di DPBS da dosare con CHX (20 mL per piastra da 10 cm).
  6. Prepara il tampone di rimozione dell'RNAsi, il lavaggio salino, il tampone di lisi e i tamponi di lavaggio (vedi Tabella 2). Per i tamponi con componenti densi/viscosi come glicerolo e Triton X-100, si pipetta il tampone completato per garantire una miscelazione uniforme. Raffredda i buffer sul ghiaccio prima dell'uso.
    NOTA: Per i passaggi di lavaggio delle perline, gira brevemente il tubo contenente le perline nel loro buffer attuale in una centrifuga tascabile per raccogliere il contenuto sul fondo. Metti il tubo in un rack magnetico per 1 minuto o finché le perline non sono completamente migrate. Aspira il sovrantagente senza toccare il pellet di perla. Senza lasciare asciugare la pellet di perla, aggiungi il prossimo tampon. Per risospendere la pallina di perle, si può pipetare delicatamente o far rotolare il tubo chiuso tra le dita tenendolo contro la griglia magnetica, in modo che le perline vengano rapidamente tirate in più direzioni dalla calamita. Infine, inverti più volte le sfere sospese per assicurarti che le pareti interne del tubo vengano lavate.
  7. Sospezione la bottiglia di stiptavidina con una leggera pipettura o dondolo. Trasferire 450 μL di sfere a un tubo a basso legame proteico per ciascuna piastra di mESC da 10 cm.
  8. Seguendo la NOTA sopra riportata sul lavaggio delle perline, scartare il buffer di stoccaggio delle perle e lavare le perle 2 volte con 900 μL di buffer di rimozione RNAsi.
    NOTA: Procedere al passo successivo senza indugio; un tempo prolungato nel buffer di rimozione dell'RNAsi può ridurre la capacità di legame delle sfere.
  9. Lava le perline 1 volta con 900 μL di lavaggio salato.
  10. Lava le perline 2 volte con 900 μL di Wash I Buffer. Dopo aver risospeso le sfere nel secondo ciclo di buffer Wash I, conservare le sfere nel buffer Wash I a 4 °C mentre si effettua attivazione e lisi cellulari.
  11. Aggiungere biotina (concentrazione finale di 50 μM; diluizione 1:1.000 di stock da 50 mM) e CHX (concentrazione finale di 100 μg/mL; diluizione 1:1.000 di stock da 100 mg/mL) a seconda delle aliquote riscaldate del substrato. Tieni a 37 °C fino all'uso.
  12. Aggiungere CHX (concentrazione finale di 100 μg/mL; diluizione 1:1.000 di 100 mg/mL) all'aliquota fredda del DPBS e conservare il raffreddamento fino all'uso.
    NOTA: I due passaggi seguenti descrivono l'attivazione di ALIBi tramite biotina supplementare e illuminazione a luce blu. Una durata ideale di attivazione è sufficiente a garantire una quantità adeguata di biotinilazione del ribosoma per i test a valle, ma abbastanza breve da preservare la risoluzione spaziotemporale. Il tempo ideale di attivazione può variare in base a parametri come il tipo cellulare, la scala dell'esperimento, il livello di espressione degli enzimi spissimi, l'abbondanza di ribosomi vicino all'organello di interesse e la sensibilità della tecnica di analisi. Raccomandiamo 15 minuti come punto di partenza, che è il tempo di attivazione utilizzato nei nostri risultati rappresentativi (Figura 2) enel lavoro correlato 30.
  13. Aspira i mezzi dalle piastre trasfatte. Aggiungi immediatamente 10 mL di mezzo caldo contenente CHX ± biotina per piatto.
  14. Per evitare che le piastre di controllo negative vengano illuminate, mettile in un incubatore buio. Per illuminare le piattie, posizionale direttamente sopra il trasilluminatore, accenderlo e incubare per 15 minuti.
  15. Quando l'illuminazione è completata, lava immediatamente le lastre due volte con 10 mL di DPBS freddo + CHX per piatta. Metti i piatti sul ghiaccio tra e dopo i lavaggi. Dopo aver aspirato il secondo lavaggio, inclina la piastra e aspira eventuali residui di DPBS.
  16. Mantenendo ogni piastra il più piatta possibile sul ghiaccio, procedi alla lisi aggiungendo 2 mL di tampone per la lisi gelata. Incubare il piatto sul ghiaccio per 5 minuti, toccando il piatto per spostare le cellule 2–3 volte durante quel tempo.
    NOTA: se tenuti scuri sotto la carta stagnola e sul ghiaccio, le piastre possono essere spostate fuori dall'area della coltura cellulare in un altro spazio buio durante questo periodo.
  17. Spostare eventuali cellule rimanenti usando una micropipetta per pipetare il lisato su e giù sulla superficie della placca, evitando la formazione di bolle, quindi trasferire il lisato in un tubo a basso legame proteico raffreddato e marcato.
    NOTA: FACOLTATIVO: Per alcuni organelli difficili da lisare come il nucleo e il nucleolo, la sonicazione può aiutare.
  18. Nel caso di organelli difficili da lisare, sonicare tutti i campioni dell'esperimento per 45 secondi a 4 °C (impostazione di potenza di 3 watt). Se il design del sonicatore richiede l'inserimento di una sonda in un tubo campione aperto, trasferire inizialmente il lisato dalla piastra in un tubo più grande per evitare il trabocco durante la sonicazione; poi, trasferiscilo su un tubo da 2 mL.
  19. Incubare il lisato sul ghiaccio per 15 minuti.
  20. Centrifugare il lisato a 17.000 × g per 3 minuti a 4 °C. Trasferire il soprannatante (lisato chiariato) in un tubo raffreddato a basso legame proteico senza disturbare la pellet di detriti cellulari.
    NOTA: Se si intende l'analisi RNA-seq, ora si può raccogliere un'aliquota del lisato chiarificato come frazione totale di RNA (vedi Supplemental File 1, "Raccomandazioni per il sequenziamento dell'RNA" passo 1.1) per i dettagli.
    NOTA: Se le quantità cellulari, le condizioni di trasfezione/coltura e le condizioni di lisi sono state uniformi per tutti i campioni, di solito assumiamo che le concentrazioni di lisato siano comparabili tra i campioni e procediamo senza quantificare la concentrazione totale di proteine. Questo minimizza il tempo trascorso tra l'attivazione e la purificazione dell'affinità.

4. Purificazione dell'affinità

  1. Sparate le perle di streptavidina lavate usando il rack magnetico. Aspira il buffer Wash I.
  2. Trasferire 1.200 μL di lisato chiarificato al tubo contenente le perle lavate. Pipetta delicatamente per sospendere le perline. Conservare il resto del lisato chiarificato a -80 °C.
  3. Incubare il lisato con perline a 4 °C al buio per 1 ora sul rotatore tubo.
  4. Durante questa incubazione, preparare il buffer di eluzione TEV (Tabella 2).

5. Eluzione

  1. Seguendo le note sul lavaggio delle perline nella sezione 3, pellet le perline su una griglia magnetica e trasferisci il soprandanante in un tubo a basso legame proteico raffreddato. Conserva il soprantantante a -80 °C.
  2. Lava le perline 2 volte con 900 μL di buffer Wash I.
  3. Lavare le perline 1 volta con 900 μL di buffer Wash II.
    NOTA: Dopo il completamento di questo passaggio, i campioni non devono più essere maneggiati al buio.
  4. Aggiungi 450 μL di tampone di eluzione TEV alle perle.
  5. Incubare le perle nel tampone di eluzione TEV per 1 ora a temperatura ambiente sul rotatore tubo. Per esperimenti su scala più piccola che utilizzano bassi volumi di tampone di eluzione TEV, si incubano i tubi su uno shaker a 1.000–2.000 giri/min.
  6. Metti i perline sul rack magnetico. Trasferisci l'eluato in un tubo a basso legame proteico. Se si intende analisi proteomica o western blot, conservare l'eluato a -80 °C. Se si intende l'analisi RNA-seq, vedere il Supplemental File 1 "Raccomandazioni per il sequenziamento dell'RNA" passo 1.2 per le istruzioni di archiviazione degli eluati.
  7. OPZIONALE: Per determinare preliminarmente se la purificazione di affinità ha prodotto rRNA/mRNA apprezzabile (indicando che i ribosomi sono stati isolati), analizzare gli eluati su uno spettrofotometro a microvolume utilizzando il buffer di eluzione TEV come blank.
    NOTA: Gli eluati provenienti da cellule contenenti il sistema attivato dovrebbero avere un'assorbenza maggiore a 260 nm rispetto agli eluati provenienti da cellule privi degli enzimi divisi, della luce blu/biotina o della L31-FTA.

6. Western blot

NOTA: Fino a quando i campioni di lisato e flusso attraverso non saranno stati denaturati nel tampone di Laemmli, raccomandiamo di continuare a evitare l'esposizione alla luce. Utilizziamo gel prefabbricati, tampone di trasferimento e tampone di funzionamento disponibili in commercio, e un sistema di trasferimento semi-secco (vedi la Tabella dei Materiali). SDS-PAGE e western blot vengono eseguiti secondo le istruzioni del produttore per questi componenti, salvo diversa indicazione di seguito.

  1. Aggiungi 6x campioni di tampone di Laemmli al lisato, flowthrough e/o eluati fino a una concentrazione finale di 1x tampone di Laemmli. Riscalda a 95 °C in un blocco riscaldante o termociclatore per 10 minuti. Se si forma condensa sul coperchio o sulle pareti dei tubi, fai girare brevemente i tubi.
  2. Installa un gel con buffer di scorrimento nel serbatoio del gel, come indicato dal produttore del serbatoio. Carica i campioni e la scala.
  3. Fai funzionare il gel a 125 V per 45–75 minuti finché il fronte del colorante non si avvicina al fondo del gel. Nel frattempo, preparare PBST e buffer di blocco (Tabella 2).
  4. Esegui un trasferimento semi-secco secondo le istruzioni del produttore del sistema di trasferimento.
    NOTA: Per tutti i passaggi di lavaggio/incubazione della membrana, assicurati che la membrana sia completamente sommersa e posiziona il vassoio della membrana su un oscillatore orbitale o inclinabile. Per un vassoio di 10 x 15 cm, questo richiede 25–50 mL di tampon.
  5. Rimuovi la membrana dalla pila di trasferimento e procedi immediatamente al passo successivo per assicurarti che la membrana non si secchi.
    NOTA: OPZIONALE: Macchie secche sulla membrana possono causare blocchi disomogenei o legame della sonda, specialmente con sonde con incubazioni brevi come la perossidasi di streptavidina-rafano piccanto. Per evitare questo problema, riinhumiamo le membrane dopo il trasferimento in metanolo al 100% per 30 secondi, poi in acqua per 5 minuti. Questa misura è simile alle raccomandazioni generali per la ri-umidificazione delle membrane PVDF che si sono asciugate dopo iltrasferimento 32,33.
  6. Lava la membrana in PBST per 3 x 10 minuti a temperatura ambiente.
  7. Seguendo le condizioni specificate nella Tabella 3 per ogni sonda western blot, eseguite il blocco, il lavaggio, l'incubazione con la sonda e l'incubazione secondaria degli anticorpi.
  8. Dopo il lavaggio finale nel passo 6.7, mescola i componenti del substrato ECL secondo le istruzioni del produttore e ricopri uniformemente la membrana. Acquisisci l'immagine su un sistema di imaging a gel chemiluminescenze.

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Risultati

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Western blot (sezione 6 del protocollo) è il modo più conveniente per valutare preliminarmente il successo di un esperimento. Quando le membrane vengono sondate con streptavidina-HRP, il lisato proveniente dalle cellule in cui erano presenti tutti i componenti del sistema dovrebbe contenere una banda corrispondente a L31-FTA biotinilata (Figura 2A, corsia 20). La stessa banda dovrebbe essere presente, solitamente a maggiore intensità, se le cellule sono stat...

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Discussione

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ALIBi offre diversi vantaggi rispetto alle tecniche esistenti per lo studio della traduzione subcellulare e ha potenziali applicazioni future nella biologia dei ribosomi e oltre. Questo protocollo richiede un tempo simile o inferiore rispetto alla lisi sequenziale e allacentrifugazione 21,22 ed è potenzialmente applicabile a qualsiasi compartimento subcellulare che possa essere geneticamente colpito con una sequenza peptidica loc...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano i membri del Barna Lab per le discussioni utili.

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Materiali

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
-80 °C storagePer coltura cellulare
0.1% gelatina in acquaMilliporeSigmaES-006-BPer coltura cellulare
Unità di filtrazione a 0,2 µmFisher04-977-158Per coltura cellulare
0,5% tripsina-EDTA (10X)ThermoFisher15400-054Per coltura cellulare
1 M MgCl2ThermoFisherAM9010Per lisi & purificazione per affinità
1 M Tris pH 7,5ThermoFisher15567027Per lisi & purificazione per affinità
1 M Tris pH 8ThermoFisherAM9855GOpzionale: per l'inserimento di FTA in un locus ribosomiale endogena
Tubi per microcentrifuga da 1,5 e 2 mL, autoclavatiPer trasfezione
Tubi per microcentrifuga da 1,5, 2 e 5 mL a basso legame proteicoEppendorf022431081, 022431102,
0030108302		Per lisi & purificazione per affinità
Piatti per coltura tissutale da 10 cmPer coltura cellulare
10 M NaOHMilliporeSigma72068-100MLPer lisi & purificazione per affinità
Concentrato di buffer di corsa 10x Tris/glicina/SDSBio-Rad1610772Per Western blot
Incubatore per coltura tissutale a 37 °C x 2Per coltura cellulare. Uno di questi serve come incubatore principale per la coltura cellulare e l'illuminazione delle cellule trasfettate. È necessario spazio temporaneo in un secondo incubatore il giorno dell'attivazione di ALIBi per ospitare le cellule trasfettate durante la configurazione del transilluminatore nell'incubatore principale.
Bagno d'acqua a 37 °CPer coltura cellulare
5 M NaClThermoFisherAM9010Per lisi & purificazione per affinità
50 mM biotinaThermoFisherB20656Per lisi & purificazione per affinità
Buffer Laemmli 6xFIsher50-196-784Per Western blot
70% etanoloPer disinfezione
AcetonitrileFisherA955Opzionale: per la preparazione del campione per spettrometria di massa
Kit proteasi AcTEVThermoFisher12575015Per lisi & purificazione per affinità
Plasmidi C-fragment ALIBiAddgene#235615, 235636 – 235641È richiesto il midi-prep per la trasfezione
Plasmidi N-fragment ALIBiAddgene#235614, 235635, 235642, 235643È richiesto il midi-prep per la trasfezione
Carta stagnolaPer lisi & purificazione per affinità
bicarbonato di ammonioMilliporeSigma5.3305Opzionale: per la preparazione del campione per spettrometria di massa
anticorpo anti-FLAGMilliporeSigmaF3165Per Western blot
anticorpo anti-GAPDHCell Signaling5174Per Western blot
anticorpo secondario anti-mouseGE HealthcareNA931VPer Western blot
anticorpo secondario anti-rabbitGE HealthcareNA934VPer Western blot
anticorpo anti-Rpl12Abcamab175219Per Western blot
anticorpo anti-Rpl31Abcamab103991Per Western blot
anticorpo anti-Rpl5ProteinTech15430-1-APPer Western blot
anticorpo anti-V5ThermoFisherR960-25Per Western blot
ApiraseNEBM0398LPer lisi & purificazione per affinità
Beta-mercaptoetanolo (55 mM)ThermoFisher21985-023Per coltura cellulare
Transilluminatore a luce bluClare Research ChemicalDR46B (piccolo) o DR196 (grande)Per lisi & purificazione per affinità
Albumina sierica bovina (BSA)FisherBP1600-100Per Western blot
Punta C18 (punte OMIX C18)AgilentA57003100Opzionale: per la preparazione del campione per spettrometria di massa
Contenitore per congelamento cellularePer coltura cellulare
Centrifugatrice adatta per tubi conici da 15 mL e/o 50 mLPer coltura cellulare
Centrifugatrice per tubi per microcentrifuga da 1,5-2 mLPer lisi & purificazione per affinità. Dovrebbe essere in grado di essere refrigerato fino a 4 C e velocità fino a 17.000 g. Idealmente, si trova in una stanza che può essere temporaneamente oscurata durante il trasferimento di tubi dentro e fuori.
Kit Clarity ECLBio-Rad170-5061Per Western blot
Vaschetta gel CriterionBio-Rad1656001Per Western blot
Gel pre-cast Criterion TGX, 4-20%Bio-Rad5671095Per Western blot. Sono disponibili dimensioni e layout di pozzetti aggiuntivi
CicloesimideMilliporeSigmaC7698-5GPer lisi & purificazione per affinità
DeossicolatoMilliporeSigmaS1827Per lisi & purificazione per affinità
DittiotreitoloThermoFisherPIA39255Opzionale: per la preparazione del campione per spettrometria di massa
DPBS, senza calcio, senza magnesioThermoFisher14190-250Per coltura cellulare
FBS qualificato ESMilliporeSigmaES-009-BPer coltura cellulare
EtanoloGold Shield412828Per Western blot
EtanoloMilliporeSigma459828Opzionale: per la preparazione del campione per spettrometria di massa
Acido formicoMilliporeSigmaA117Opzionale: per

Riferimenti

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