Articolo metodologico

Effetti neuroprotettivi dell'analogo dell'octadecaneuropeptide somministrato per via intranasale in un modello murino di malattia di Parkinson indotta da MPTP

DOI:

10.3791/68122

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29 agosto 2025

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1Faculty of Sciences of Tunis, LR18ES03, Laboratory of Neurophysiology Cellular Physiopathology and Biomolecule Valorization, University Tunis El Manar, 2Inserm U1239 NorDiC, Laboratory of Neuroendocrine, Endocrine and Germinal Differentiation and Communication, PRIMACEN, Univ Rouen Normandie, 3Confocal Microscopy Unit, Faculty of Medicine of Tunis, University Tunis El Manar

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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La somministrazione intranasale consente la somministrazione diretta di molecole bioattive al cervello, fornendo un'alternativa non invasiva al metodo intracerebroventricolare. Questo studio dimostra che la somministrazione intranasale di ciclo(1-8)OP, un analogo dell'ODN, esercita forti effetti neuroprotettivi contro il danno ossidativo indotto da MPTP e l'apoptosi nello striato in un modello murino di malattia di Parkinson, evidenziando il potenziale terapeutico.

Abstract

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La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa per la quale le terapie esistenti sono principalmente palliative e mancano di efficacia curativa. L'octadecaneuropeptide (ODN) è un peptide prodotto esclusivamente dagli astrociti che protegge i neuroni dal danno ossidativo cellulare e dall'apoptosi in modelli in vitro e in vivo di PD. Tuttavia, l'ODN non può attraversare la barriera emato-encefalica (BEE) e richiede un'iniezione intracerebroventricolare per raggiungere il cervello, presentando una sfida significativa per l'applicazione terapeutica. Questo studio indaga l'efficacia neuroprotettiva del ciclo(1-8)OP, un analogo dell'ODN, somministrato per via intranasale (IN) per bypassare la BBB in un modello in vivo di PD. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J e divisi in quattro gruppi: sham, MPTP- (20 mg/kg di peso corporeo, intraperitoneale), ciclo(1-8)OP- (10 ng/10 μL, IN) e MPTP + animali trattati con ciclo(1-8)OP. Il giorno 0 (D0), gli animali hanno ricevuto tre iniezioni intraperitoneali di 100 μL di soluzione MPTP a intervalli di 2 ore (topi trattati con MPTP e MPTP + ciclo(1-8)OP) o soluzione salina (topi trattati con sham e ciclo(1-8)OP). Un'ora dopo l'iniezione finale, sono stati somministrati 10 μL di instillazione di ciclo(1-8)OP (topi trattati con ciclo(1-8)OP e MPTP + ciclo(1-8)OP) o soluzione salina IN (topi fittizi e trattati con MPTP). Su D7 è stato eseguito un test del cilindro per valutare la funzione del motore. Successivamente, gli animali sono stati sacrificati e lo striato è stato rimosso e analizzato mediante RT-qPCR per valutare l'espressione genica della caspasi-3. I campioni di tessuto sono stati utilizzati anche per misurare le attività degli enzimi antiossidanti, le specie reattive dell'ossigeno (ROS), la malondialdeide (MDA) e l'abbondanza di proteine carbonilate. Una singola dose di IN di 10 ng di ciclo(1-8)OP, somministrata 1 ora dopo la dose finale di MPTP, ha prevenuto la neurotossicità nello striato 7 giorni dopo il trattamento. La neuroprotezione mediata da ciclo(1-8)OP è stata associata a una forte inibizione dell'espressione della caspasi-3 indotta da MPTP nello striato. Inoltre, il ciclo(1-8)OP ha ripristinato l'attività degli enzimi antiossidanti, prevenendo l'accumulo di ROS, prodotti di perossidazione lipidica e carbonilazione delle proteine nello striato.

Introduzione

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La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa caratterizzata dalla progressiva perdita di neuroni dopaminergici nella substantia nigra, che innerva lo striato. Questa perdita provoca sintomi neurologici significativi, tra cui gravi deficit motori come rigidità muscolare, acinesia e bradicinesia1. La prevalenza di malattie neurodegenerative come il Parkinson continua ad aumentare, principalmente a causa dell'invecchiamento della popolazione, che rappresenta una notevole sfida per la salute pubblica2. Gli attuali trattamenti per la malattia di Parkinson si basano prevalentemente su analoghi dopaminergici e sulla stimolazione intracerebrale ad alta frequenza 3,4. Tuttavia, queste terapie mancano di effetti neuroprotettivi e non riescono ad arrestare la progressione della malattia, sottolineando l'urgente necessità di strategie innovative per prevenire la perdita neuronale, promuovere la rigenerazione e mitigare l'avanzamento della malattia5.

L'ottadecaneuropeptide (ODN) è un peptide derivato dal processamento proteolitico dell'inibitore legante il diazepam (DBI)6 precursore di 86 aminoacidi, espresso principalmente dalle cellule astrogliali nel sistema nervoso centrale dei mammiferi. La conservazione evolutiva della struttura primaria dell'ODN suggerisce i suoi ruoli biologici significativi. È stato dimostrato che l'ODN regola funzioni chiave come l'assunzione di cibo, il sonno, l'aggressività e i comportamenti legati all'ansia. Oltre al suo ruolo regolatorio, un'ampia ricerca ha dimostrato le proprietà neuroprotettive dell'ODN in vari disturbi neurologici associati alla degenerazione neuronale. Ad esempio, l'ODN protegge i neuroni dopaminergici in un modello di PD8 e riduce le dimensioni dell'infarto, migliorando al contempo il recupero funzionale dopo l'ictus nei roditori9. Una delle caratteristiche principali dell'ODN è la sua capacità di contrastare molti processi deleteri attivati durante il danno cerebrale attraverso le sue attività anti-apoptotiche, antinfiammatorie, antiossidanti e immunomodulanti 10,11,12. Inoltre, l'ODN può agire oltre la fase acuta dell'ictus promuovendo la neurogenesi e la plasticità neuronale9. Per le potenziali applicazioni cliniche dei peptidi o dei loro analoghi come agenti terapeutici, la scelta di una via di somministrazione ottimale è fondamentale per prevenire la rapida degradazione nel flusso sanguigno e ridurre al minimo l'effetto di primo passaggio. Tra le varie strategie di somministrazione, la somministrazione intranasale (IN) è emersa come una promettente alternativa non invasiva, che consente la somministrazione diretta di alcune molecole bioattive al cervello bypassando la barriera emato-encefalica (BBB)13,14,15. Questa via elimina la necessità di iniezioni stereotassiche invasive e migliora la biodistribuzione cerebrale rispetto agli organi periferici. Ad esempio, il polipeptide attivante l'adenilato ciclasi ipofisaria (PACAP) ha dimostrato una maggiore efficacia nell'assorbimento cerebrale e nella neuroprotezione quando somministrato mediante instillazione di IN rispetto all'iniezione endovenosa, riducendo significativamente il volume dell'infarto e migliorando il recupero funzionale nei modelli di ictus9.

Sebbene la somministrazione di IN sia una tecnica minimamente invasiva ed efficiente per somministrare agenti terapeutici direttamente al cervello bypassando la BEE, la sua efficacia rimane dipendente da diversi parametri pratici, tra cui la dose e il volume totale somministrato. Nei roditori, il volume raccomandato varia tipicamente da 10 a 25 μl per narice per evitare l'aspirazione o il trabocco nel tratto gastrointestinale16,17. L'efficienza dell'assorbimento nasale è influenzata anche dalle dimensioni dell'animale, dalla superficie della cavità nasale, dalla clearance mucociliare e dalle proprietà dei composti come la lipofilia e il peso molecolare18,19. Questi vincoli dovrebbero essere considerati durante la progettazione del protocollo per garantire la riproducibilità e la rilevanza traslazionale nei modelli preclinici.

Uno studio in vivo ha dimostrato che l'iniezione intracerebroventricolare (ICV) di basse dosi di ODN ha conferito significativi effetti neuroprotettivi, in particolare prevenendo la degenerazione dei neuroni dopaminergici nei topi trattati con MPTP8. Il presente studio mira a valutare la fattibilità e l'efficacia della somministrazione di IN dell'analogo ODN, ciclo(1-8)OP, come alternativa non invasiva all'iniezione di ICV per la somministrazione di un analogo peptidico neuroprotettivo al cervello, in particolare per determinare se questa via può prevenire la perdita neuronale dopaminergica e migliorare gli esiti motori nei topi trattati con MPTP, un modello consolidato di PD.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti hanno seguito le linee guida dell'American Veterinary Medical Association e sono stati approvati dal Comitato Etico Medico dell'Istituto Pasteur (numero di approvazione: FST/LNFP/Pro 160220). Topi maschi C57BL/6J di dieci settimane sono stati ottenuti dall'Istituto Pasteur di Tunisi. I topi sono stati alloggiati in tre per gabbia in una stanza a temperatura controllata (21 °C ± 1 °C) con un ciclo luce/buio di 12 ore e hanno avuto libero accesso a cibo e acqua per 1 settimana di acclimatazione. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Procedura di trattamento

  1. Dividi gli animali in quattro gruppi: sham (n = 9), MPTP- (n = 9), ciclo(1-8)OP- (n = 9) e MPTP + ciclo(1-8)OP-trattato (n = 9).
  2. Somministrare tre iniezioni intraperitoneali (IP) di MPTP (20 mg/kg p.c.) in 100 μL di NaCl allo 0,9% a intervalli di 2 ore il primo giorno di trattamento (D0). 1 ora dopo l'ultima iniezione di MPTP, somministrare 10 μL per via intranasale (IN) di ciclo(1-8)OP (10 ng) o soluzione fisiologica.
  3. Iniettare negli animali di controllo soluzione fisiologica invece di MPTP, con o senza ciclo(1-8)OP (Figura 1).
  4. Il settimo giorno (D7), sottoporre i topi al test del cilindro. Quindi anestetizzare profondamente i topi utilizzando un'iniezione IP di pentobarbital e sacrificarli (seguendo protocolli approvati istituzionalmente) per raccogliere cervelli per la PCR in tempo reale e le analisi biochimiche20 (Figura 2).

2. Procedura di iniezione

  1. Iniezione intraperitoneale
    1. Posizionare il mouse con attenzione e immobilizzare la testa durante la procedura.
    2. Orientare il mouse a testa in giù per consentire agli organi di spostarsi naturalmente con la gravità, riducendo al minimo il contatto con l'ago.
    3. Inserire l'ago con un angolo di 45 gradi nell'addome inferiore.
    4. Somministrare tre iniezioni da 100 μl sullo stesso lato, con un intervallo di 2 ore tra ogni iniezione, tutte eseguite lo stesso giorno.
    5. Iniettare soluzione fisiologica allo 0,9% per i gruppi sham e cyclo(1-8)OP, o soluzione MPTP (20 mg/kg p.c.) per i gruppi MPTP e MPTP + cyclo(1-8)OP.
  2. Somministrazione intranasale
    NOTA: La dose selezionata (10 ng) si basava su uno studio precedente che dimostrava l'efficacia neuroprotettiva della somministrazione ICV di ODN8. Il volume totale di 10 μL e la dimensione delle goccioline (5 μL per narice) sono stati scelti in base ai protocolli di somministrazione IN stabiliti 18,21. Questo volume è ben al di sotto della capacità media della cavità nasale del topo (0,032 cm3), riducendo così al minimo il rischio di ostruzione o asfissia delle narici e garantendo un assorbimento nasale sicuro ed efficiente22.
    1. Tenere saldamente il mouse per la collottola, assicurandosi che il naso sia orientato verso l'alto per facilitare un dosaggio preciso e ridurre al minimo il movimento della testa.
    2. Capovolgere l'animale in modo che il suo lato ventrale sia rivolto verso il soffitto, con il collo parallelo al pavimento. Assicurarsi che la testa del mouse rimanga saldamente immobilizzata, impedendo il movimento verticale o orizzontale.
    3. Allineare la punta della pipetta con la narice del topo e premere lentamente lo stantuffo per formare una piccola gocciolina.
    4. Posizionare una goccia da 5 μl (metà del volume) vicino a ciascuna delle narici del topo.
    5. Lasciare che il mouse inali naturalmente la soluzione.
    6. Ripetere questi passaggi per garantire un dosaggio costante, con 10 μL di ciclo(1-8)OP (10 ng) somministrati per i gruppi MPTP + ciclo(1-8)OP e ciclo(1-8)OP.
    7. Osservare attentamente la bocca del topo durante tutta la procedura. La presenza di liquido in bocca può indicare un assorbimento nasale incompleto. Ciò potrebbe derivare da una dimensione impropria delle goccioline, da una somministrazione rapida o da un'inalazione insufficiente, consentendo alla soluzione di accumularsi nel rinofaringe e successivamente di uscire attraverso la bocca.
    8. Ridurre al minimo questo rischio riducendo le dimensioni delle goccioline, se necessario, e garantendo un tempo adeguato per l'inalazione prima di somministrare volumi aggiuntivi.
    9. Evitare di somministrare immediatamente una dose aggiuntiva per evitare un volume eccessivo.
    10. Documentare eventuali dosi fuori luogo e annotare attentamente il liquido espulso.
    11. Assicurarsi che ogni topo inali completamente entrambe le goccioline (una per narice) prima di procedere con l'ulteriore somministrazione.
    12. Confermare il puntamento accurato del bulbo olfattivo eseguendo un'iniezione IN di soluzione di blu di metilene.
    13. Valuta l'accuratezza ispezionando visivamente la deposizione e la diffusione della colorazione blu.

3. Test del cilindro

  1. Utilizzare un cilindro trasparente, di 20 cm di altezza e 15 cm di diametro, posto al centro del tavolo.
  2. Posizionare tre pannelli di cartone nero attorno al cilindro (a 4-8 cm di distanza) per ridurre al minimo gli effetti di luce ambientale. Lasciare un lato del cilindro aperto per la registrazione video.
  3. Posizionare la telecamera a 40-60 cm dal cilindro per catturarne la visione completa.
  4. Posiziona il mouse nel cilindro e inizia subito a registrare per 5 minuti.
  5. Dopo che ogni topo ha completato il test, pulisci il cilindro con acqua, spruzza etanolo al 70% per rimuovere gli odori e asciugalo prima di testare il topo successivo.
  6. Riprodurre la registrazione a velocità dimezzata per consentire un'osservazione dettagliata.
  7. Conta ogni caso in cui il topo solleva le zampe contro la parete del cilindro per valutare il comportamento esplorativo23.

4. Preparazione di estratti di tessuto cerebrale per esperimenti biochimici

  1. Anestetizzare gli animali con pentobarbital (40 mg/kg, IP) e poi decapitarli (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
  2. Sezionare lo striato e omogeneizzare in 2 mL di TBS per grammo di tessuto utilizzando il tampone di lisi (1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA).
  3. La centrifuga omogeneizza a 14.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
  4. Misurare la concentrazione di proteine utilizzando il kit di determinazione colorimetrica Biuret e conservare le aliquote a -20 °C per analisi successive.

5. Misura della formazione di ROS intracellulari

  1. Incubare l'estratto di tessuto cerebrale con 10 μM di DCFH2-DA a 37 °C per 30 minuti al buio.
  2. Rimuovere il surnatante e lavare due volte con PBS (0,1 M, pH 7,4, 37 °C).
  3. Misurare la fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre a una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 538 nm.

6. Misura dei marcatori di stress ossidativo

  1. Malondialdeide
    1. Miscelare 20 μL di campione (~50 μg di proteine) con 125 μL di TCA al 20% e 50 μL di TBA allo 0,67%.
    2. Incubare a 95 °C per 30 minuti, quindi raffreddare rapidamente a 4 °C.
    3. Aggiungere 800 μl di butanolo, vortex e centrifugare a 3000 × g per 10 minuti a 4 °C.
    4. Misurare l'assorbanza a 532 nm e calcolare i livelli di MDA utilizzando il coefficiente di estinzione (1,65 × 105 M-1 cm-1).
  2. Misura delle proteine carbonile
    1. Miscelare 200 μl di DNPH con 50 μl di campione proteico e incubare per 1 ora.
    2. Aggiungere 250 μl di TCA al 20% e raffreddare per 10 minuti con ghiaccio.
    3. Centrifugare a 3000 × g per 10 min a 4 °C e lavare il pellet con TCA al 10%, quindi con etanolo:acetato di etile (v/v).
    4. Risospendere il pellet in 250 μl di guanidina cloridrato 6 M e misurare l'assorbanza a 370 nm.
    5. Calcolare i livelli di PCO utilizzando il coefficiente di estinzione (22.000 M-1 cm-1)24.

7. Misurazione delle attività enzimatiche antiossidanti

  1. Saggio della superossido dismutasi
    1. Incubare il campione (~50 μg) con catalasi bovina (0,4 U/L), DL-epinefrina (5 mg/mL) e tampone Na2CO3/NaHCO3 (62,5 mM, pH 10,2).
    2. Misurare l'ossidazione dell'epinefrina a 480 nm utilizzando uno spettrofotometro per 300 s a intervalli di 60 s25.
  2. Dosaggio della catalasi
    1. Miscelare il campione con 90 mM H2O2 in PBS.
    2. Monitorare la diminuzione dell'assorbanza di H2O2 a 240 nm per 3 minuti a intervalli di 30 s.
    3. Calcolare l'attività della CAT utilizzando il coefficiente di estinzione (40 M-1 cm-1).

8. Analisi PCR in tempo reale

  1. Estrarre l'RNA totale dallo striato di topo utilizzando il metodo del tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinio acido.
  2. Trattare l'RNA con DNasi I per rimuovere il DNA genomico e misurare la concentrazione di RNA a 260 nm.
  3. Eseguire la RT-PCR quantitativa utilizzando 1 μg di RNA totale con un kit Q-RT PCR in un solo passaggio.
  4. Amplificare il cDNA con SYBR Green PCR Master Mix e primer (Tabella 1).
  5. Calcola i livelli relativi di cDNA utilizzando il metodo 2−ΔΔCt con GAPDH come controllo interno26.

9. Analisi statistica

  1. Esegui analisi statistiche utilizzando il software GraphPad.
  2. Usa il t-test di Student per confronti singoli. Per confronti multipli, utilizzare l'ANOVA a una o due vie seguita dal test post hoc di Bonferroni, a seconda dei casi. In tutti i casi, considerare un valore P di 0,05 o inferiore come statisticamente significativo.

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Risultati

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Dopo la somministrazione di MPTP, i topi hanno mostrato sintomi parkinsoniani caratteristici, tra cui una coda di Straub rialzata e rigida, piloerezione, immobilità e anomalie posturali come la curvatura spinale, confermando il successo dell'instaurazione del modello MPTP (Figura 3). La verifica della somministrazione di IN utilizzando il blu di metilene, con topi sacrificati 10 minuti dopo l'iniezione, ha mostrato un'efficace distribuzione del colorante all'interno del bulb...

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Discussione

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Studi precedenti hanno dimostrato che la somministrazione ICV di ODN ha contrastato la degenerazione indotta da MPTP dei neuroni dopaminergici nigrostriatali, il danno ossidativo e la neuroinfiammazione8. L'attuale indagine ha valutato l'efficacia della somministrazione di IN dell'analogo ODN, ciclo(1-8)OP, per prevenire le menomazioni motorie, il danno ossidativo e la neurotossicità indotte da MPTP in un modello di PD in vivo utilizzando topi ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Laboratorio di Neurofisiologia, Fisiopatologia Cellulare e Valorizzazione delle Biomolecole, LR18ES03, NorDiC Inserm U1239, dal programma di scambio France-Tunisia CMCU-Campus France/PHC Utique 24G0807/50283RD (a Olfa Masmoudi-Kouki e Jérôme Leprince), dal Programma Horizon-Marie Skłodowska-Curie Actions (MSCA) PsyCoMed Grant agreement ID: 101086247 e dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito della convenzione di sovvenzione Marie Skłodowska Curie No 101034329.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2', 7'-diclorofluorescina DCFH2-DASigma Aldrich064M4008V
Spettrofotometro Bio-Rad Laboratori Bio-Rad, Filadelfia, PA, Stati Uniti
Butanolo
Macchina fotografica
Catalasi da fegato bovinoSIGMA scienze della vitaSLBZ7596
ciclo(1-8)OPINSERM U1239 NorDiC, Rouen
Prova del cilindro (becher graduato)
DNPH 
EDTA plusTermo Scientifico11836714
Etanolo 70%
Soluzione di etanolo-etilacetato
Software GraphPad La Jolla, CA, Stati Uniti
cloridrato di guanidinaGeneON5CCAE310
H2O2 Distretto di PharmaghrebAEQ10101-D
Siringa da insulina 2ml
L-epinefrina MP Biomedicali151065
Blu di metilene Termo Chimica Scientifica10455081
Micropipetta 
Lettore di micropiastre Synergy LX-AgilentSinergia LX-Agilent
Impianto MPTPMedChemExpressHY-15608
Impianto MPTP
Na2CO3/NaHCO3 buffer 
NaCl 0,9
kit PCR Q-RT in un solo passaggio Biolaboratori del New England
Pentobarbital Sigma Aldrich
Spettrofotometro Synergy LX Nanodrop 2000Biotek Agilent
Acido tiobarbiturico (TBA, 0,67%) LOBA CHEMIE PVT. LTD626500025
Suggerimenti
Acido tricloroacetico (TCA, 20%)Sisco Laboratori di Ricerca SRL6740608
Tri-reagente Sigma AldrichMFCD00213058
Tris-HClTermo ScientificoJ22638. K2
Triton X-100Termo ScientificoA16046.AE

Riferimenti

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