Un flusso di lavoro pratico per l'analisi dei dati di transcriptomica spaziale: dall'acquisizione dei dati alle analisi avanzate

Sommario

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro riproducibile per l'analisi di dati di transcriptomica spaziale, guidando l'utente dall'acquisizione di dati pubblici e dal controllo di qualità basato su Seurat, attraverso integrazione, rilevamento di caratteristiche spaziali, deconvoluzione del tipo cellulare, annotazione di regioni di interesse e analisi della comunicazione cellula-cellula, con punti di controllo pratici che supportano un'esecuzione trasparente.

Abstract

La trascrittomica spaziale (ST) analizza l'espressione genica su scala genomica preservando il contesto spaziale bidimensionale delle molecole di mRNA all'interno di sezioni di tessuto, consentendo studi sull'architettura tissutale e sulla biologia associata al microambiente. Tuttavia, l'analisi della ST rimane complessa poiché l'importazione dei dati, il controllo di qualità, l'integrazione, la deconvoluzione, le statistiche spaziali e la visualizzazione richiedono spesso ambienti software multipli e scelte di parametri riproducibili. Questo protocollo presenta un flusso di lavoro computazionale pratico per dataset pubblici di ST in R, partendo dall'acquisizione dei dati e dalla configurazione del software, per proseguire con il caricamento dei dati basato su Seurat, controllo di qualità, normalizzazione, integrazione multiplo, clustering e analisi dei geni variabili nello spazio. Il flusso di lavoro applica quindi strategie complementari di deconvoluzione, inclusa l'analisi SPOTlight guidata da riferimento e la modellizzazione a topic non supervisionata STdeconvolve, seguita dall'analisi della comunicazione cellulare spaziale basata su Giotto e dalla selezione interattiva di regioni di interesse (ROI) mediante un'applicazione personalizzata in Python Dash. Sottolineando l'esecuzione basata su script, le giustificazioni esplicite dei parametri, gli output attesi e i punti di controllo per la risoluzione dei problemi, il protocollo fornisce un quadro adattabile per dataset di ST basati su array standard e piattaforme correlate, dopo una valutazione dei parametri specifici per dataset e piattaforma.

Introduzione

La trasmissione spaziale del trascrittoma (ST) è una famiglia rivoluzionaria di tecnologie che misura l'espressione genica su scala genomica mantenendo le coordinate spaziali delle molecole di RNA messaggero (mRNA) all'interno di sezioni di tessuto. I metodi ST comprendono approcci basati sul sequenziamento che utilizzano matrici con codici a barre posizionali e approcci di imaging in situ che mappano i segnali trascrizionali all'interno di microambienti tissutali integri^1,2. Preservando il contesto spaziale, la ST consente l'analisi dell'architettura tissutale, dell'organizzazione delle vicinanze cellulari, della comunicazione tra cellule e dei processi biologici associati al microambiente che non possono essere completamente risolti dopo la dissociazione del tessuto³.

La rapida crescita dei repository pubblici di dati ST ha creato opportunità senza precedenti per l'analisi secondaria e lo sviluppo di metodi³. Risorse come il database CROST curano centinaia di dataset trascrittomica risolta spazialmente provenienti da diverse specie e piattaforme tecnologiche, mentre collezioni specializzate come STOmicsDB si concentrano su metodologie specifiche quali Stereo-seq^4,5. Nonostante l'abbondanza di dati, l'analisi computazionale rimane complessa a causa della struttura complessa dei dati spaziali, della diversità degli strumenti analitici e degli ostacoli tecnici nell'implementare flussi di lavoro riproducibili^{6,7,8,9,10,11}.

Per affrontare i limiti derivanti dall'uso di un singolo ambiente software, viene qui presentato un flusso di lavoro computazionale integrato che sfrutta strumenti analitici complementari. Gli ecosistemi esistenti per l'analisi di dati ST comprendono principalmente Seurat, Giotto e framework basati su Python come Squidpy^6,7,12. Sebbene strumenti basati su Python come Squidpy offrano funzionalità estese per l'analisi di grafi spaziali, consolidare la principale pipeline computazionale all'interno di un unico ambiente linguistico riduce gli ostacoli tecnici legati all'interoperabilità tra linguaggi. Di conseguenza, la pipeline principale è implementata principalmente in R per minimizzare tali difficoltà tecniche. All'interno di questo flusso di lavoro basato su R, Seurat viene utilizzato per il caricamento dei dati, il controllo di qualità, la normalizzazione, la riduzione della dimensionalità, la visualizzazione e l'integrazione di campioni multipli, riflettendo il suo uso comune nei flussi di lavoro di trascrittomica singola-cellula e spaziale. Successivamente, Giotto viene impiegato per la costruzione di reti spaziali e per l'analisi della comunicazione cellulare basata su ligandi-recettori. Pertanto, questa pipeline collega la pre-elaborazione e l'integrazione basate su Seurat con l'analisi spaziale basata su Giotto, mantenendo esplicito e riproducibile il trasferimento dei dati tra i due insiemi di strumenti.

All'interno di questo framework, vengono implementate due strategie complementari di deconvoluzione: SPOTlight, un metodo guidato da riferimento che utilizza dati di scRNA-seq per stimare le proporzioni dei tipi cellulari, e STdeconvolve, un metodo di modellazione argomentale non supervisionato che identifica modelli trascrizionali latenti^8,11. Gli output forniscono visioni complementari dell'eterogeneità cellulare spaziale, ma non sono considerati una validazione incrociata quantitativa a meno che gli utenti non eseguano l'analisi di concordanza facoltativa descritta nel protocollo. Un'applicazione Python Dash personalizzata, Select Spatial Spots, è integrata per l'annotazione interattiva di regioni di interesse (ROI) ed esporta file di annotazione standard basati su coordinate che possono essere utilizzati in analisi successive.

Per quanto riguarda l'applicabilità pratica, questo flusso di lavoro è concepito principalmente per dati ST basati su array standard (ad esempio, Visium con risoluzione di 55 µm) e potrebbe essere adattato ad altri tipi di tessuto dopo una valutazione dei parametri. Prima dell'analisi, è necessario considerare alcune limitazioni fondamentali. In primo luogo, il modulo di deconvoluzione guidata da riferimento richiede un riferimento scRNA-seq di alta qualità e corrispondente al tessuto in esame. In secondo luogo, piattaforme subcellulari o quasi monocellulari potrebbero richiedere una pre-elaborazione modificata, un'aggregazione spaziale dei bin o una segmentazione cellulare basata su immagini prima dell'integrazione². Il dataset rappresentativo del colon di topo viene utilizzato come caso dimostrativo per mostrare come il flusso di lavoro possa valutare domini spaziali e l'organizzazione tissutale definita da marcatori, piuttosto che come prova di compatibilità universale della piattaforma.

Protocollo

Tutti i set di dati biologici analizzati in questo protocollo sono disponibili pubblicamente e utilizzati esclusivamente a scopo dimostrativo. Gli accessi specifici ai dati e i repository di origine sono indicati nei passaggi pertinenti. I set di dati originali sono stati generati dai ricercatori responsabili nel rispetto delle linee guida etiche istituzionali applicabili a ciascuno studio di origine. Consultare la Tabella dei Materiali per verificare tutte le versioni richieste di software e pacchetti R.

Requisiti hardware: La memoria computazionale necessaria per questo flusso di lavoro aumenta in base al numero di campioni e di punti analizzati. Per un dataset tipico di trascrittomica spaziale (ad esempio, circa 3.000 punti per campione su un massimo di tre campioni), una workstation standard con un minimo di 16 GB di RAM è sufficiente per eseguire il pipeline. Tuttavia, si raccomanda vivamente di disporre di almeno 32 GB di RAM o più per garantire prestazioni e stabilità ottimali, in particolare durante le fasi computazionali più gravose in termini di memoria, come la normalizzazione SCTransform e la fattorizzazione della matrice durante la deconvoluzione.

1. Acquisizione dei dati e preparazione della struttura delle directory

1. Ottenere set di dati pubblici di transcriptomica spaziale (ad esempio, accessione GEO GSE169749, con data di invio 26 marzo 2021 e ultima data di aggiornamento 6 marzo 2022) e dati di riferimento di RNA-seq a singola cellula (ad esempio, accessione GEO GSE264408, con data di invio 19 aprile 2024 e ultima data di aggiornamento 10 dicembre 2024).
2. Scaricare l'archivio dei dati grezzi (ad esempio, GSE169749_RAW.tar) dal repository ed estrarre l'archivio.
   NOTA: Per il set di dati rappresentativo utilizzato in questo protocollo, la directory estratta contiene più file per ogni campione, i cui nomi di file includono tipicamente l'accession number del campione GEO (ad esempio, GSM5213483).
3. Organizzare i file in una struttura di directory standardizzata compatibile con Seurat Load10X_Spatial funzione.
   1. Creare una directory principale per i dati (ad esempio, ./data/).
   2. Creare una sottodirectory dedicata per ogni campione (ad esempio, ./data/sample_A1/).
   3. Trasferire (copiare o spostare) i seguenti file essenziali per ogni campione nelle rispettive sottocartelle.
      1. Posizionare il filtered_feature_bc_matrix.h5 inserire nella sottodirectory principale del campione.
      2. Crea un spaziale/ sottocartella all'interno di ogni directory del campione
      3. Inserire i seguenti file nella spaziale/ sottocartella: tissue_positions_list.csv.gz, scalefactors_json.json.gz e tissue_hires_image.png.gz.
   4. Decomprimere il .gz file nella spaziale/ cartella. Assicurarsi che i nomi originali dei file rimangano esattamente come richiesto dal Load10X_Spatial funzione (ad es., tissue_positions_list.csv).
      NOTA: La struttura finale, organizzata per un caricamento senza interruzioni, deve seguire questo schema, utilizzando il campione A1 come esempio:
      ./data/campione_A1/filtered_feature_bc_matrix.h5
      ./data/campione_A1/spaziale/posizioni_tessuto_elenco.csv
      ./data/campione_A1/spaziale/fattori_di_scala_json.json
      ./data/campione_A1/spaziale/immagine_tessuto_alta_risoluzione.png

2. Configurazione dell'ambiente software

1. Installare R (versione 4.4.3 o successiva).
2. Acquisire gli script di analisi (1_ReadSpatialData.R fino a 8_Giotto_Communication.R) dal repository GitHub (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow, al commit hash 2d85e18 per garantire la riproducibilità).
3. Installare i pacchetti R richiesti da CRAN e Bioconductor eseguendo lo script setup.R.
   NOTA: Un elenco completo delle versioni specifiche dei pacchetti utilizzati in questo flusso di lavoro è fornito nella Tabella dei Materiali ed è disponibile anche nel file session_info.txt all'interno del repository GitHub associato (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow).
4. Installare la Giotto Suite eseguendo i comandi di installazione forniti nella documentazione ufficiale.
   1. Accedere all'URL ufficiale di installazione per recuperare gli script di configurazione: https://giottosuite.com/articles/installation.html
   2. Inizializzare l'ambiente Python richiesto e le dipendenze di sistema seguendo le istruzioni passo dopo passo.
5. Installare pacchetti aggiuntivi per una visualizzazione avanzata.
   1. Eseguire: install.packages(c("ggprism", "colorBlindness"))
6. Installare lo strumento personalizzato Select Spatial Spots. Assicurarsi che il sistema operativo sia Windows, macOS o Linux e che sia installata la versione di Python 3.8 o successiva. Questo passaggio è facoltativo.
   1. Acquisire lo strumento accedendo al repository GitHub (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots, al commit hash d20946e per garantire la riproducibilità) e scaricando il codice sorgente.
   2. Entrare nella directory dello strumento e installare le dipendenze Python: pip install -r requirements.txt
7. Installare il pacchetto glmGamPoi eseguendo BiocManager::install("glmGamPoi") per accelerare la normalizzazione SCTransform.
   NOTA: Il flusso di lavoro principale richiede soltanto i pacchetti elencati nei passaggi 2.1–2.3 e 2.6. Il pacchetto Rfast2 viene utilizzato per velocizzare il calcolo della statistica di Moran's I. I pacchetti facoltativi del passaggio 2.5 servono per generare grafici pronti per la pubblicazione con un tema in stile prism (ggprism) e per accedere a una tavolozza di colori adatta ai daltonici (colorBlindness). Lo strumento del passaggio 2.6 abilita la funzionalità interattiva di selezione dei punti. Eseguire il comando sessionInfo() e salvare l'intero output della console in un file di testo. Questo documento registra esattamente le versioni del software e le dipendenze dei pacchetti, elementi fondamentali per garantire la riproducibilità a lungo termine.

3. Caricamento dei dati spaziali e controllo di qualità (1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)

1. Caricare i dati spaziali negli oggetti Seurat.
   1. Utilizzare Read10X_Image per caricare manualmente l'immagine tissutale ad alta risoluzione, specificando image.dir e image.name.
   2. Utilizzare Load10X_Spatial con il parametro image impostato sull'oggetto immagine creato al punto 3.1.1 per creare l'oggetto Seurat.
2. Calcolare le metriche di controllo qualità.
   1. Calcolare la percentuale di letture mitocondriali utilizzando PercentageFeatureSet con il pattern ^mt-.
3. Visualizzare e interpretare i dati in base alle metriche di controllo qualità.
   1. Generare grafici a violino di nCount_Spatial, nFeature_Spatial e percent.mt utilizzando VlnPlot.
   2. Creare grafici spaziali delle caratteristiche per queste metriche utilizzando SpatialFeaturePlot per identificare i punti al di fuori dell'area del tessuto.
      NOTA: Punto di controllo visivo: i punti al di fuori dell'area del tessuto mostrano tipicamente un numero basso di conteggi UMI (nCount_Spatial < 500) e una bassa rilevazione genica (nFeature_Spatial < 200).
   3. A scopo dimostrativo, applicare filtri per rimuovere i punti di bassa qualità (ad esempio, subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial > 200 & nCount_Spatial > 500)). Questo è un passaggio opzionale.
      NOTA: L'obiettivo principale del controllo qualità nella trascrittomica spaziale è identificare e annotare gli artefatti tecnici, come i punti al di fuori del tessuto. Per i dati dimostrativi del colon Visium, nFeature_Spatial > 200 e nCount_Spatial > 500 rimuovono i punti a bassa complessità o di fondo. Per tessuti con contenuto ridotto di RNA o sezioni degradate, esaminare i grafici a violino e i grafici spaziali delle caratteristiche prima di aumentare le soglie; per tessuti densi o con alto numero di UMI, potrebbero essere appropriate soglie più stringenti. Evitare di filtrare esclusivamente in base a valori elevati di espressione, a meno che non siano visibili doppietti, piegature del tessuto o chiari artefatti. Il filtraggio spesso non è raccomandato poiché rimuove fisicamente posizioni spaziali, il che potrebbe alterare la continuità della struttura tissutale nelle analisi spaziali successive.

4. Pre-elaborazione, integrazione e raggruppamento dei dati (3_IntegrationAndClustering.R)

1. Normalizzare e pre-elaborare i singoli campioni.
   1. Applicare la normalizzazione SCTransform a ciascun campione separatamente con assay = Spatial.
2. Integrare più campioni.
   1. Preparare l'elenco degli oggetti normalizzati con SCT per l'integrazione. Assicurarsi che ogni oggetto abbia un assay "RNA" copiando l'assay "Spatial": spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["Spatial"]]
      ​NOTA: Copiare l'assay "Spatial" in uno slot assay "RNA" standard rappresenta una soluzione necessaria per garantire la compatibilità con le funzioni di integrazione successive, originariamente progettate per oggetti Seurat a singola cellula.
   2. Utilizzare SelectIntegrationFeatures e PrepSCTIntegration per identificare le caratteristiche variabili condivise.
   3. Trovare gli ancoraggi di integrazione utilizzando FindIntegrationAnchors con normalization.method = "SCT".
   4. Integrare i dati utilizzando IntegrateData con normalization.method = "SCT".
3. Eseguire la riduzione della dimensionalità e il clustering sull'assay integrato.
   1. Eseguire PCA sui dati integrati utilizzando RunPCA.
   2. Determinare il numero ottimale di componenti principali (PC) per l'analisi successiva calcolando la varianza cumulativa spiegata. Identificare il punto del gomito in modo programmato (ad esempio, il punto in cui la varianza cumulativa supera il 90% e il guadagno marginale scende al di sotto dello 0,1%), utilizzando il codice in 3_IntegrationAndClustering.R, righe 36-38. Il numero risultante di PC sarà indicato in seguito come pc.use.
   3. Eseguire RunUMAP con dims = 1:pc.use.
   4. Effettuare il clustering delle cellule utilizzando FindNeighbors con dims = 1:pc.use e FindClusters con resolution = 0,5. Modificare la risoluzione solo dopo aver verificato la stabilità dei cluster e la coerenza dei geni marcatore.
   5. Eseguire l'analisi dell'espressione differenziale tra gruppi di interesse (ad esempio, "B1_colon_d14" rispetto a "A1_colon_d0") utilizzando la funzione FindMarkers.
      ​NOTA: Controllo visivo: un'integrazione corretta mostrerà un adeguato mescolamento dei campioni nel grafico UMAP, mantenendo al contempo cluster biologicamente distinti.
4. Identificare i geni variabili nello spazio.
   1. Per ciascun campione originale, eseguire FindSpatiallyVariableFeatures utilizzando il metodo "moransi" sull'assay "SCT" per calcolare l'autocorrelazione spaziale.

5. Pre-elaborazione dei dati di riferimento a singola cellula (4_scDataPreProcessing.R)

1. Leggere la matrice di conteggio dell'RNA-seq a singola cellula utilizzando Read10X e creare un oggetto Seurat.
2. Eseguire il controllo di qualità standard, la normalizzazione e il clustering.
   1. Calcolare la percentuale di letture mitocondriali (percent.mt) e filtrare le cellule (ad esempio, nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25).
   2. Normalizzare i dati utilizzando SCTransform, impostando vars.to.regress = "percent.mt".
   3. Eseguire PCA, UMAP e raggruppare le cellule utilizzando il metodo dinamico di selezione dei componenti principali descritto al punto 4.3.2.
3. Assegnare l'annotazione dei tipi cellulari.
   1. Calcolare i punteggi dei moduli per i geni marcatore canonici dei tipi cellulari utilizzando AddModuleScore.
   2. Assegnare l'annotazione ai cluster in base ai punteggi dei moduli e alle conoscenze biologiche disponibili. In alternativa, importare annotazioni pre-calcolate dai metadati.

6. Deconvoluzione guidata da riferimento con SPOTlight (5_SPOTlight_Deconv.R)

1. Preparare i dati per SPOTlight.
   1. Convertire l'oggetto Seurat annotato a singola cellula e l'oggetto Seurat spaziale in oggetti SingleCellExperiment.
   2. Normalizzare in scala logaritmica i dati a singola cellula utilizzando logNormCounts.
2. Eseguire la deconvoluzione con SPOTlight.
   1. Identificare i geni ipervariabili (HVGs) sui dati a singola cellula utilizzando modelGeneVar e getTopHVGs.
   2. Calcolare i geni marcatore per tipo cellulare utilizzando scoreMarkers e filtrare per marcatori ad alta qualità (ad esempio, mean.AUC > 0,8).
   3. Sottocampionare il riferimento a singola cellula per ogni tipo cellulare a un numero gestibile (ad esempio, 50 cellule) per ridurre il tempo computazionale.
   4. Eseguire la deconvoluzione utilizzando la funzione SPOTlight con weight_id = "mean.AUC", group_id = "cluster" e gene_id = "gene".
3. Visualizzare ed esportare i risultati.
   1. Estrarre la matrice risultante dalla deconvoluzione (proporzioni dei tipi cellulari per spot).
   2. Utilizzare plotSpatialScatterpie per visualizzare la composizione cellulare sulle coordinate spaziali.
   3. Aggiungere i risultati della deconvoluzione ai metadati dell'oggetto Seurat spaziale utilizzando AddMetaData. Risultato atteso: una matrice di deconvoluzione con colonne contenenti le proporzioni dei tipi cellulari per ogni spot spaziale, grafici scatterpie spaziali che mostrano la composizione cellulare locale e un oggetto Seurat contenente le proporzioni di deconvoluzione come metadati.

7. Deconvoluzione indipendente dal riferimento con STdeconvolve (7_STdeconvolve.R)

1. Preparare i dati spaziali.
   1. Estrarre la matrice di conteggio grezza dall'oggetto spaziale Seurat utilizzando GetAssayData con slot = "counts".
   2. Rimuovere i punti e i geni di bassa qualità utilizzando cleanCounts di STdeconvolve (ad esempio, min.lib.size = 100).
2. Identificare i tipi cellulari latenti.
   1. Filtrare ulteriormente il corpus per i geni espressi in una frazione minima di punti utilizzando restrictCorpus (ad esempio, removeAbove=1.0, removeBelow = 0.05).
   2. Adattare un modello Latent Dirichlet Allocation (LDA) su un intervallo di numeri di argomenti potenziali (K) (ad esempio, Ks = seq(2, 9, by = 1)) utilizzando fitLDA.
   3. Selezionare il modello ottimale in base alla perplessità minima utilizzando optimalModel con opt = "min".
3. Analizzare e visualizzare i risultati.
   1. Estrarre le proporzioni dei tipi cellulari (argomenti) (theta) e i profili genici (beta) dal modello ottimale utilizzando getBetaTheta.
   2. Per facilitare l'interpretazione biologica degli argomenti deconvoluti, importare le annotazioni delle regioni di interesse (ROI) generate dallo strumento "Select Spatial Spots" (vedere passaggio 9.3.3). Utilizzare queste annotazioni come parametro groups nella funzione vizAllTopics per proiettare le proporzioni dei tipi cellulari deconvoluti nuovamente sulle coordinate spaziali e codificare i punti per colore in base al loro ROI. Questo è un passaggio facoltativo.
      NOTA: Risultato atteso: STdeconvolve dovrebbe restituire valori theta che rappresentano le proporzioni degli argomenti per ogni punto e valori beta che rappresentano i profili genici per ciascun argomento. Se gli utenti desiderano confrontare quantitativamente i risultati non supervisionati di STdeconvolve con gli output guidati da riferimento di SPOTlight (dal Passaggio 6), possono esportare entrambe le matrici di proporzioni (theta da STdeconvolve e la matrice SPOTlight) e calcolare metriche di correlazione o concordanza per ogni punto (ad esempio, correlazione di Pearson o Spearman) utilizzando funzioni R standard. Il confronto quantitativo tra SPOTlight e STdeconvolve è facoltativo e non è richiesto per l'esecuzione del flusso di lavoro principale; tuttavia, le matrici di output pertinenti sono disponibili dai Passaggi 6.3.1 e 7.3.1 per gli utenti che desiderano effettuare tale analisi.

8. Comunicazione spaziale tra cellule mediante Giotto(8_Giotto_Communication.R)

1. Convertire l'oggetto Seurat in un oggetto Giotto.
   1. Utilizzare la funzione createGiottoObject, fornendo la matrice dei conteggi grezzi e le coordinate spaziali.
2. Pre-elaborare l'oggetto Giotto e aggiungere i risultati della deconvoluzione.
   1. Normalizzare i dati utilizzando normalizeGiotto.
   2. Aggiungere le annotazioni dei tipi cellulari (ad esempio, il tipo cellulare principale ottenuto dalla deconvoluzione SPOTlight) ai metadati cellulari utilizzando addCellMetadata.
3. Inferire la comunicazione cellula-cellula informata spazialmente.
   1. Creare una rete spaziale utilizzando createSpatialNetwork con method = "Delaunay" e name = "Delaunay_network".
   2. Caricare un database di ligandi-recettori nell'ambiente R. Assicurarsi che l'oggetto caricato sia formattato come un data frame con due colonne distinte che rappresentano i simboli genici del ligando e del recettore (ad esempio, una rete murina precompilata da Zenodo: https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content, versione v6, pubblicata il 7 aprile 2025).
   3. Eseguire exprCellCellcom con cluster_column = "celltype_major" per identificare interazioni significative ligando-recettore tra tipi cellulari che sono in prossimità spaziale. Risultato atteso: una tabella contenente coppie ligando-recettore, combinazioni di tipi cellulari sorgente e bersaglio, valori di log2 fold-change e valori di P aggiustati; conservare le interazioni significative (ad esempio, p.adj < 0,05) per la visualizzazione.

9. Selezione interattiva di spot con selezione di spot spaziali (6_SelectSpatialSpots.R)

1. Preparare i dati per lo strumento interattivo.
   1. Estrarre le coordinate spaziali dall'oggetto Seurat utilizzando GetTissueCoordinates.
2. Formattare ed esportare i dati.
   1. Formattare il frame di dati delle coordinate in modo che contenga esattamente le intestazioni di colonna: CELL_ID, X e Y.
   2. Esportare il frame di dati formattato in un file CSV.
3. Eseguire l'analisi della regione di interesse (ROI).
   1. Avviare l'applicazione personalizzata Dash Select Spatial Spots e caricare il file CSV.
   2. Selezionare interattivamente i punti in base alla posizione spaziale.
   3. Esportare l'elenco dei punti selezionati e le relative etichette di gruppo/ROI assegnate in un nuovo file CSV. Risultato previsto: un file CSV contenente gli identificatori dei punti, le coordinate X/Y e le etichette di gruppo/ROI assegnate, che possono essere associati nuovamente all'oggetto Seurat tramite CELL_ID.

Risultati

Implementazione del flusso di lavoro e integrazione dei dati illustrano le caratteristiche principali del tessuto

Il flusso di lavoro computazionale è stato applicato ai dati di trascrittomica spaziale del colon del topo per illustrare gli output attesi in ciascuna fase analitica. Come mostrato nello schema del flusso di lavoro (Figura 1), la procedura è iniziata con l'acquisizione dei dati e il controllo di qualità, in cui i grafici delle caratteristiche spaziali hanno delineato i confini del tessuto (Figura 2A,B). Successivamente, è stato utilizzato il flusso di lavoro di integrazione basato su ancoraggi di Seurat per ridurre gli effetti tecnici di lotto preservando al contempo la variazione biologica interpretabile. Le visualizzazioni UMAP hanno mostrato l'allineamento dei campioni e i modelli di raggruppamento spaziale dopo l'integrazione (Figura 2C,D). È stata implementata una selezione quantitativa e dinamica dei componenti principali (PC) basata sulla varianza cumulativa per guidare la riduzione dimensionale e il raggruppamento successivo (vedi Figura supplementare 1). L'analisi della mappa termica dei geni marcatore ha rivelato profili trascrizionali distinti alla base dei cluster spaziali (Figura 2E).

Per valutare se gli aggregati computazionali fossero coerenti con l'architettura anatomica nota dell'istologia del colon, sono stati analizzati i profili di espressione dei geni marcatore specifici per strato. Lo strato dell'epitelio mucosale ha mostrato espressione di marcatori delle cellule epiteliali, tra cui Epcam e Krt8, insieme al marcatore delle cellule caliciformi Muc2. Marcatori mesenchimali e stromali come Col1a1 e Vim hanno identificato la lamina propria e le regioni sottomucose, mentre lo strato esterno della muscolaris propria è stato indicato da geni strutturali delle cellule muscolari lisce come Acta2 e Tagln. La localizzazione spaziale di questi marcatori associati alla linea cellulare supporta l'interpretazione secondo cui il flusso di lavoro di integrazione e raggruppamento ha preservato le principali stratificazioni istologiche del tessuto colico lungo l'asse dalla mucosa alla muscolaris (vedi Supplementary Figure 2).

Dopo la convalida dei cluster, è stata eseguita un'analisi differenziale dell'espressione genica per identificare i geni differenzialmente espressi (DEG) tra le condizioni sperimentali (Figura 2F,G). Inoltre, i geni con variabilità spaziale sono stati identificati mediante la statistica di Moran's I, evidenziando i geni con una distribuzione spaziale significativamente non casuale nel tessuto (Figura 2H).

La deconvoluzione cellulare e le reti di interazione spaziale rivelano la microorganizzazione del tessuto

L'elaborazione dei dati di riferimento dell'RNA-seq a singola cellula ha prodotto annotazioni supportate dal filtraggio di controllo qualità (Figura 3A), dal clustering non supervisionato (Figura 3B), dalla validazione dei geni marcatore (Figura 3C) e dalla concordanza con annotazioni indipendenti (Figura 3D). La composizione cellulare (Figura 3E) ha guidato la strategia di sottocampionamento per la deconvoluzione. SPOTlight ha stimato le proporzioni dei tipi cellulari guidate dal riferimento attraverso i punti spaziali (Figura 4A,B), mentre STdeconvolve ha fornito una visione basata su modellazione per argomenti non supervisionata dei modelli cellulari spaziali (Figura 5B). Lo strumento personalizzato Select Spatial Spots ha fornito il contesto istologico per questi modelli (Figura 5A). Infine, utilizzando le assegnazioni dei tipi cellulari deconvolute, l'analisi della comunicazione spaziale ha identificato interazioni ligando-recettore tra gruppi di tipi cellulari prossimali nello spazio (Figura 6A,B).

Osservazioni per la risoluzione dei problemi derivanti dall'ottimizzazione del protocollo

Durante l'ottimizzazione del protocollo, sono stati identificati diversi problemi che hanno suggerito punti di controllo pratici. Risultati di deconvoluzione subottimali si sono verificati quando i riferimenti monocellulari non corrispondevano adeguatamente al contesto del tessuto, indicando la necessità di utilizzare dati scRNA-seq abbinati al tessuto e alla specie, quando disponibili. I primi tentativi di clustering con parametri predefiniti non hanno sempre risolto le strutture biologiche attese; l'analisi della selezione delle componenti principali (PC), della risoluzione del clustering e della coerenza dei geni marcatore ha aiutato a identificare domini interpretabili spazialmente, allineati con l'anatomia del tessuto. Queste osservazioni forniscono esempi pratici di come gli utenti possono diagnosticare problemi analitici comuni durante l'esecuzione del flusso di lavoro.

Figura 1: Flusso di lavoro per l'analisi integrata della trascrittomica spaziale. Rappresentazione schematica della pipeline analitica, dall'acquisizione e pre-elaborazione dei dati fino alle analisi spaziali avanzate. I passaggi chiave includono: (1) Caricamento dei dati, controllo di qualità e integrazione multi-campione mediante Seurat; (2) Raggruppamento spaziale e rilevamento di geni variabili nello spazio; (3) Deconvoluzione dei tipi cellulari tramite metodi basati su riferimento (SPOTlight) e non supervisionati (STdeconvolve); (4) analisi della comunicazione spaziale tra cellule con Giotto e selezione interattiva di regioni di interesse mediante uno strumento personalizzato, Selezionare punti spazialiI risultati di tutti i moduli vengono sintetizzati per ricavare informazioni biologiche sull'architettura tissutale e sul microambiente cellulare. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Integrazione dei dati, raggruppamento e analisi dell'espressione differenziale. (A,B) Metriche di controllo qualità per i campioni spaziali A1 e B1, che mostrano le distribuzioni dei conteggi genici, dei conteggi UMI e delle percentuali di geni mitocondriali. (C) Visualizzazione UMAP dei dati integrati di trascrittomica spaziale, colorati in base all'origine del campione (a sinistra) e all'identità del raggruppamento (a destra). (D) Proiezione spaziale delle identità dei cluster sulle sezioni di tessuto. (E) Mappa termica dei geni marcatore principali per ciascun cluster spaziale. (F) Diagramma a vulcano che mostra i geni differenzialmente espressi tra le condizioni A1_colon_d0 e B1_colon_d14. (G) Pattern di espressione spaziale di geni rappresentativi differenzialmente espressi attraverso le sezioni di tessuto. (H) Mappe di espressione spaziale dei principali geni variabili spazialmente identificati tramite la statistica di Moran's I, con i due pannelli a sinistra che mostrano geni del campione A1_colon_d0 e i due pannelli a destra che mostrano geni del campione B1_colon_d14. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Elaborazione e annotazione dei dati di riferimento a singola cellula. (A) Metriche di controllo qualità per i dati di riferimento scRNA-seq prima e dopo il filtraggio. (B) Visualizzazione UMAP dei dati scRNA-seq colorata in base ai cluster non supervisionati. (C) Diagramma a punti che mostra i punteggi di espressione dei geni marcatore canonici per tipo cellulare nei diversi cluster. (D) Visualizzazione UMAP annotata dei dati scRNA-seq con i principali tipi cellulari indicati. (E) Composizione cellulare del dataset di riferimento scRNA-seq. La linea rossa tratteggiata indica la soglia di sottocampionamento (n = 50 cellule per tipo) applicata durante la deconvoluzione SPOTlight per bilanciare efficienza computazionale e rappresentatività del tipo cellulare. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Deconvoluzione spaziale dell'eterogeneità cellulare. (A,B) Diagrammi a torta spaziali da deconvoluzione SPOTlight che mostrano la composizione proporzionale dei principali tipi cellulari in ogni spot per i campioni A1 (A) e B1 (B). (C) Distribuzione spaziale rappresentativa delle cellule B nei campioni A1 (sinistra) e B1 (destra), che illustra i modelli di localizzazione risolti spazialmente di una specifica popolazione di cellule immunitarie identificata mediante deconvoluzione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Analisi interattiva delle regioni di interesse e confronto della deconvoluzione non supervisionata. (A) Interfaccia dello strumento personalizzato "Seleziona punti spaziali" che mostra la selezione interattiva di regioni corrispondenti al colon prossimale, colon distale e altri domini tissutali. (B) Visualizzazione spaziale a grafico a torta dei risultati della deconvoluzione non supervisionata (STdeconvolve) per il campione A1, con i punti colorati in base alle regioni annotate manualmente in (A), che illustra la corrispondenza tra annotazione basata sull'istologia e distribuzioni computazionali degli argomenti cellulari. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Reti di comunicazione cellula-cellula informate dalla localizzazione spaziale. (A,B) Reti di interazione ligando-recettore inferite da Giotto per i campioni A1 (A) e B1 (B). I nodi rappresentano i tipi cellulari, gli archi rappresentano coppie significative di ligando-recettore (FDR < 0,05) e lo spessore degli archi corrisponde all'intensità dell'interazione. Per garantire confrontabilità e chiarezza visiva, è stata applicata una soglia di significatività uniforme (FDR < 0,05) su tutti i campioni, e vengono mostrate le prime 20 interazioni ordinate per log2FC per ciascuna condizione. Le reti evidenziano schemi di comunicazione specifici per tipo cellulare nel contesto spaziale del tessuto del colon. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Valutazione quantitativa dell'ottimizzazione dei parametri per la riduzione della dimensionalità. Il grafico del gomito illustra l'approccio automatizzato del flusso di lavoro per selezionare in modo dinamico il numero ottimale di componenti principali (PC). La selezione viene calcolata in base alle soglie di deviazione standard cumulativa e di varianza marginale, rappresentate dalla linea verticale rossa, al fine di catturare la varianza biologica riducendo al contempo il rumore tecnico prima del raggruppamento successivo.Cliccare qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Validazione del raggruppamento spaziale mediante marcatori specifici dei classici strati del colon. (A) Diagramma a punti che mostra l'espressione arricchita di marcatori epiteliali, stromali e muscolari lisci nei diversi cluster computazionali. (B) Rappresentazioni spaziali di marcatori rappresentativi (Epcam, Col1a1, Acta2) proiettati sulle coordinate del tessuto.Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro computazionale completo per l'analisi dei dati di trascrittomica spaziale, che coniuga profondità analitica e accessibilità pratica. L'approccio passo dopo passo guida i ricercatori attraverso l'intero percorso analitico, dalla acquisizione iniziale dei dati fino ad analisi spaziali avanzate, sottolineando al contempo i punti critici decisionali e i potenziali ostacoli.

Diversi passaggi del protocollo richiedono particolare attenzione a causa del loro impatto sui risultati successivi. Le soglie di controllo qualità e filtraggio devono essere attentamente adattate ai tipi specifici di tessuto e alle piattaforme tecnologiche, poiché un filtraggio eccessivamente rigoroso potrebbe rimuovere spot biologicamente rilevanti, mentre soglie troppo permissive possono introdurre rumore tecnico. La scelta del metodo di normalizzazione influenza in modo significativo i risultati successivi di clustering ed espressione differenziale. Ad esempio, la pipeline utilizza SCTransform invece della normalizzazione logaritmica standard perché si è riscontrato che SCTransform modella e riduce la variazione tecnica associata alla profondità di sequenziamento e ad altri effetti tecnici nei flussi di lavoro single-cell e spaziali^14,15. Durante l'integrazione, la selezione delle caratteristiche di integrazione e dei parametri di risoluzione richiede un'attenta valutazione per bilanciare la forza di integrazione con la conservazione del segnale biologico. Per l'individuazione di geni variabili spazialmente, è stato scelto Moran's I per la sua scalabilità computazionale e idoneità all'analisi di autocorrelazione spaziale in dati basati su array, anche se possono essere considerati chiamatori alternativi come SPARK a seconda delle dimensioni del dataset e degli obiettivi dello studio¹⁶.

Il componente relativo alla risoluzione dei problemi di questo flusso di lavoro si concentra sui comuni problemi di interoperabilità che si verificano quando si passano gli output da un pacchetto al successivo. Piuttosto che fare affidamento su un singolo passaggio generico di conversione, il flusso di lavoro utilizza conversioni di formato personalizzate a ciascuna interfaccia software: i dati spaziali di conteggio vengono copiati in uno slot di saggio RNA standard prima dell'integrazione con Seurat; gli oggetti di riferimento Seurat e single-cell vengono convertiti in oggetti SingleCellExperiment per SPOTlight; le matrici di conteggio spaziali vengono riformattate per STdeconvolve; i conteggi, le coordinate e i metadati relativi ai tipi cellulari derivati da Seurat vengono convertiti in un oggetto Giotto per l'analisi della comunicazione cellula-cellula; e le annotazioni delle ROI da Select Spatial Spots vengono esportate come file CSV con CELL_ID, coordinate X/Y ed etichette di gruppo, in modo che possano essere ricollegate all'oggetto Seurat. Questi passaggi aiutano gli utenti a identificare e correggere problemi comuni come slot di saggio incompatibili, identificatori di spot non corrispondenti, colonne di metadati mancanti, formattazione errata delle coordinate e discrepanze nei simboli genici ligando-recettore.

Una caratteristica aggiuntiva di questo flusso di lavoro è l'uso di due strategie complementari di deconvoluzione anziché il ricorso a un singolo algoritmo. SPOTlight utilizza riferimenti scRNA-seq preesistenti per la stima guidata da riferimento delle proporzioni dei tipi cellulari, mentre STdeconvolve consente la scoperta indipendente da riferimenti di argomenti trascrizionali latenti. Nel set di dati dimostrativo, gli argomenti identificati da STdeconvolve si allineavano con regioni definite istologicamente (Figura 5B), confermando l'interpretabilità biologica. Un confronto quantitativo diretto tra i due metodi non è stato effettuato in questo protocollo; gli utenti che desiderano confrontarli sui propri dati possono seguire il framework fornito nel passaggio 7.3.2 del protocollo. Inoltre, il protocollo favorisce usabilità e tracciabilità utilizzando script per le funzioni principali, offrendo al contempo un'interfaccia grafica (Seleziona punti spaziali) per un isolamento intuitivo delle aree di interesse.

Collegare Seurat e Giotto consente al flusso di lavoro di combinare la pre-elaborazione e l'integrazione basate su Seurat con le statistiche spaziali e l'analisi delle reti basate su Giotto. Seurat fornisce un ambiente consolidato per ricercatori con esperienza in scRNA-seq e supporta l'integrazione di dati multi-campione, mentre il trasferimento dei dati armonizzati in Giotto permette la costruzione di reti spaziali e l'analisi ligando-recettore. Questa progettazione consente agli utenti di sfruttare i punti di forza documentati di entrambe le piattaforme senza implicare che siano stati confrontati qui con Squidpy o altri framework. Per la comunicazione tra cellule, è stata utilizzata l'inferenza ligando-recettore basata sulla rete di Delaunay di Giotto poiché incorpora l'adiacenza spaziale all'interno dello stesso ambiente analitico; framework come CellChat offrono ampie basi di dati sui segnali, ma non vengono valutati nel presente protocollo¹⁷.

Devono essere considerati diversi limiti. L'approccio di deconvoluzione basato su riferimenti dipende fortemente dalla disponibilità di riferimenti singola-cellula di alta qualità e abbinati. Inoltre, le assunzioni fondamentali alla base dell'analisi della comunicazione tra cellule si basano sulla co-espressione trascrizionale come indicatore di interazione fisica tra proteine, richiedendo una successiva validazione sperimentale. Infine, questo flusso di lavoro è stato sviluppato principalmente per dataset Visium standard. Con il progresso del settore verso tecnologie con risoluzione quasi singola-cellula, come Visium HD, le considerazioni analitiche cambieranno; dati con risoluzione più elevata potrebbero richiedere parametri di pre-elaborazione diversi e ridurre la necessità assoluta della deconvoluzione dei punti. Per adattare questo flusso di lavoro a dataset Visium HD, i bin ad alta risoluzione possono essere aggregati computazionalmente in bin spaziali più grandi, oppure i moduli di deconvoluzione dei punti possono essere ignorati a favore di una segmentazione cellulare basata su immagini¹⁸.

Queste caratteristiche suggeriscono un'ampia applicabilità in diversi ambiti biologici, tra cui la biologia dello sviluppo, le neuroscienze, la ricerca sul cancro e l'immunologia^19,20,21,22. Il design modulare consente ai ricercatori di adattare specifici componenti alle proprie esigenze, sia che si concentrino sull'identificazione di domini spaziali, sulla comunicazione cellulare o sulla specializzazione regionale. Con il progressivo sviluppo delle tecnologie spaziali e l'espansione dei set di dati, questo protocollo fornisce una base che può essere estesa per integrare nuovi metodi analitici e affrontare domande biologiche emergenti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ggplot2	Posit Software, PBC	v4.0.0(CRAN)	Visualizzazione avanzata dei dati
Giotto	Dries Lab	v4.2.2 (GitHub)	Analisi di reti spaziali e comunicazione tra cellule
patchwork	Thomas Lin Pedersen	v1.3.2 (CRAN)	Composizione e disposizione dei grafici
R software	Fondazione R per il Calcolo Statistico	v4.4.3	Ambiente principale di esecuzione (macOS aarch64)
scater	Davis McCarthy et al.	v1.34.1 (Bioconductor)	Controllo qualità e visualizzazione a singola cellula
scran	Aaron Lun et al.	v1.34.0 (Bioconductor)	Modellazione della varianza a singola cellula e rilevamento di marcatori
Select Spatial Spots (Strumento Python personalizzato)	LeafLight	v1.0.0 (GitHub)	Selezione interattiva di regioni di interesse spaziali (ROI) (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)
Seurat	Satija Lab	v5.3.0 (CRAN)	Pre-elaborazione, integrazione e raggruppamento dei dati spaziali
SeuratObject	Satija Lab	v5.2.0 (CRAN)	Strutture dati per dati a singola cellula e spaziali
SingleCellExperiment	Squadra principale di Bioconductor	v1.28.1 (Bioconductor)	Contenitore standardizzato per dati scRNA-seq
SPOTlight	Marc Elosua-Bayes et al.	v1.10.0 (Bioconductor)	Deconvoluzione spaziale guidata da riferimento
Stdeconvolve	Jean Fan Lab	v1.3.2 (Bioconductor)	Modellazione non supervisionata di argomenti latenti
tidyverse	Posit Software, PBC	v2.0.0 (CRAN)	Pacchetto principale per manipolazione e formattazione dei dati