Una piattaforma digitale di elettroporazione microfluidica per l'editing del genoma CRISPR a basso input e la trasfezione di mRNA in cellule T in sospensione e modelli di celle 3D

Sommario

Questo protocollo descrive la miniaturizzazione del genoma CRISPR–Cas9 del recettore TCRα/β nelle cellule T umane primarie utilizzando 'DMF-ection', una piattaforma di elettroporazione microfluidica digitale (DMF). Il metodo consente l'editing genico parallelo e a basso input con alta vitalità ed è ulteriormente adattabile per la somministrazione di mRNA in sferoidi 3D multicellulari.

Abstract

L'elettroporazione microfluidica digitale (DMF) consente una manipolazione genetica precisa e a basso volume delle cellule dei mammiferi, minimizzando l'input cellulare fino a 100 volte e preservando la vitalità. Questo studio presenta un flusso di lavoro di trasfezione ad alta produttività basato su DMF per l'eliminazione mediata da CRISPR del locus TRAC nelle cellule T in sospensione primaria umana e per la trasfezione di mRNA di sferoidi HEK293T tridimensionali. Utilizzando RNA guida CRISPR depositati spazialmente e assemblaggio di ribonucleoproteine (RNP) su cartuccia, è stata raggiunta una perturbazione efficiente del locus TRAC sia nelle popolazioni di cellule T CD4⁺ che CD8⁺ utilizzando solo 10.000 cellule per condizione, con vitalità post-editing superiori all'85%. La caratterizzazione biofisica tramite analisi indotte dal flusso e dispersione di Taylor ha rivelato che gli additivi polimerici stabilizzano i complessi Cas9–sgRNA in condizioni di tampone di elettroporazione, supportando l'editing riproducibile a volumi submicrolitri. Il flusso di lavoro è stato ulteriormente adattato per applicazioni 3D inserendo l'mRNA EGFP in sferoidi HEK293T intatti, ottenendo una fluorescenza robusta e spazialmente uniforme senza compromettere la crescita o la morfologia degli sferoidi. Insieme, questi risultati dimostrano che l'elettroporazione del DMF consente un'editing efficace del genoma e la consegna dell'mRNA sia nelle cellule immunitarie in sospensione sia negli sferoidi multicellulari. Questa piattaforma offre una soluzione scalabile e a basso input per applicazioni nella terapia con cellule CAR-T, nella genomica funzionale e nei modelli cellulari 3D avanzati.

Introduzione

L'editing genico nelle cellule umane primarie è sempre più centrale sia per lo sviluppo terapeutico che per la ricerca di base, incluse applicazioni nell'immunoingegneria, nella modellazione di malattie rare e nella genomica^funzionale. Sebbene l'elettroporazione consenta un'editing genomica altamente efficiente, i sistemi convenzionali basati su cuvette richiedono tipicamente fino a milioni di cellule per condizione, limitandone l'uso per campioni derivati dal paziente e popolazioni immunitarie^{rare 2}. Inoltre, questi sistemi sono poco adatti allo screening su larga scala a causa di limitazioni di throughput, automazione e consumo^{di reagenti 3}.

L'elettroporazione microfluidica è emersa come un approccio promettente per l'editing genomico a basso^{input 4}. Tuttavia, la maggior parte delle piattaforme esistenti si basa su architetture a flusso continuo che prevedono una gestione complessa dei fluidi, una flessibilità limitata nella miscelazione dei reagenti e requisiti relativamente elevati per celle per condizione. Al contrario, la microfluidica digitale (DMF) consente la manipolazione attiva di gocce discrete in scala nanolitrica su un array di elettrodi planari, consentendo un controllo preciso sulla composizione della reazione, sul tempismo e sulla localizzazione spaziale. Questo formato plug-and-play basato su gocce è particolarmente adatto a workflow a basso volume e alta produttività, dove la conservazione di cellule primarie e reagenti è^{essenziale 5}.

Lavori recenti hanno dimostrato la fattibilità della consegna intracellulare basata su DMF utilizzando architetture di elettroporazione a tri-gocce che generano campi elettrici localizzati a bassa corrente per una consegna efficiente di RNP e mRNA minimizzando allo stress termico ed^{elettrochimico 6,7,8}. Sulla base di queste basi, è stata sviluppata una piattaforma di elettroporazione DMF di nuova generazione, denominata 'DMF-ection', con 48 siti di reazione indirizzabili indipendentemente, piena compatibilità con l'automazione e una produzione scalabile^{di cartucce 9} (Figura 1). La cartuccia DMF è composta da una piastra PCB inferiore e una piastra superiore in plastica separate da una guarnizione, assemblate tramite bottoni di allineamento in un'unica orientazione corretta (Figura 1A). La disposizione 48-plex è organizzata in otto famiglie identiche (Figura 1A–H), ciascuna contenente sei siti di elettroporazione indirizzabili indipendentemente, supportando fino a 48 condizioni di editing parallelo per cartuccia (Figura 1B). Le librerie di RNA guida vengono depositate sulla superficie del substrato tramite un distributore acustico prima dell'assemblaggio della cartuccia. La precisione posizionale della deposizione è stata confermata in tutti i 48 siti, con le posizioni di caduta che si raggruppano entro una deviazione sub-millimetrica dal punto medio dell'elettrodo (Figura 1C), supportando un affidabile assemblaggio RNP sulla cartuccia. Dopo il caricamento, celle e gocce di elettrodi liquidi vengono attivate sulla cartuccia per formare la geometria di elettroporazione a tri-gocce (Figura 1D). Dopo l'elettroporazione, le cellule vengono scaricate in piastre di coltura per il recupero e l'analisi a valle, inclusi citometria di flusso, sequenziamento e microscopia (Figura 1E). Questo sistema consente un'elevata efficienza di editing genomico utilizzando fino a 100 volte meno cellule rispetto ai metodi standard basati su cuvette, ampliando significativamente l'accesso all'ingegneria genomica in applicazioni a basso input e ad alto rendimento.

Questo studio valuta le prestazioni della piattaforma consegnando molteplici carichi biomolecolari, inclusi complessi di ribonucleoproteine (RNP) mRNA e CRISPR–Cas9, ottenendo una trasfezione efficiente e una perturbazione genica. Oltre alle cellule T primarie, la DMF-ection fornisce un quadro generalizzabile per la consegna degli acidi nucleici in strutture multicellulari complesse. Gli sferoidi tridimensionali (3D) e i modelli di tipo organoide impongono barriere significative alla penetrazione dei reagenti a causa della loro architettura e fragilità, e gli approcci convenzionali di elettroporazione spesso interrompono la morfologia o generano una consegna eterogenea. Per valutare se gli stessi principi miniaturizzati di elettroporazione utilizzati per l'editing delle cellule T si estendano ai tessuti strutturati, il flusso di lavoro DMF è stato applicato agli sferoidi HEK293T 3D. Questi esperimenti hanno dimostrato che l'elettrobagnatura basata su DMF può posizionare delicatamente sferoidi intatti all'interno delle geometrie tri-gocce e sostenere una distribuzione uniforme dell'mRNA preservando al contempo struttura e crescita. Sebbene questi risultati siano al di fuori del protocollo principale per cellule T descritto qui, illustrano la più ampia applicabilità dell'elettroporazione DMF programmabile per i sistemi cellulari 3D emergenti rilevanti per la scoperta di farmaci e la modellazione delle malattie.

Protocollo

Le cellule T umane primarie utilizzate in questo protocollo sono state ottenute da fornitori commerciali con il consenso informato del donatore e in conformità con le linee guida istituzionali, etiche e normative applicabili. Tutta la gestione di materiali biologici di origine umana è stata effettuata in conformità con i protocolli di biosicurezza istituzionale. I ricercatori che implementano questo protocollo sono responsabili di garantire che l'uso delle cellule umane primarie sia conforme ai requisiti del comitato di revisione istituzionale locale (IRB) o del comitato etico, alle normative applicabili sulla biosicurezza e a qualsiasi legislazione nazionale o regionale pertinente che regoli l'uso del materiale biologico umano. Nessuna informazione identificabile dal paziente è stata associata al materiale cellulare utilizzato in questo studio.

1. Preparazione e attivazione delle cellule T umane primarie

1. Lo scongelamento criopreserva rapidamente le cellule T primarie umane CD3⁺ in un bagno d'acqua a 37 °C. Trasferire le celle in un mezzo basale per cellule T preriscaldato e centrifugare a 180 × g per 10 minuti. Scartare il soprandanante e risospendere il pellet in un mezzo fresco.
2. Determina la concentrazione e la vitalità cellulare utilizzando un contatore cellulare automatizzato.
3. Sospendere le cellule a 1 × 10⁶ cellule/mL in un mezzo di coltura per cellule T integrato con uno stimolo attivatore di anticorpi tetramerico solubile CD3/CD28 (secondo le istruzioni del fornitore) e 200 IU/mL di IL-2. Incubare le cellule per 72 ore a 37 °C, 5% CO₂.
   NOTA: Mantenere la densità cellulare tra 0,5–2 × 10⁶ cellule/mL durante l'attivazione. Eseguire l'attivazione nelle piastre U-bottom a 96 pozzi per ottimizzare l'efficienza del contatto cellula-attivatore e dell'attivazione.

2. Preparazione di macchie di RNA guida sul substrato DMF (spotting acustico del distributore)

1. Ricostituire sgRNA liofilizzato in acqua priva di nucleasi a una concentrazione stock di 100 μM. In un tubo separato, preparare una riserva da 100 mg/mL di poli-L-glutamamo (PGA, sale di sodio, MW 15.000–50.000 Da) in acqua priva di nucleasi. Combinare sgRNA e stocco PGA a un rapporto di volume 5:4 (sgRNA: PGA) che produce una concentrazione finale di sgRNA di 55,6 pmol/μL e una concentrazione finale di PGA di 44,4 mg/mL in acqua priva di nucleasi. Vortice brevemente e centrifuga a 1.000 × g per 30 secondi e aliquote in volumi monouso, e conserva le aliquote inutilizzate a −80 °C per un massimo di 6 mesi.
   NOTA: Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
2. Aggiungere la miscela guida-PGA a una piastra sorgente acustica a basso volume morto nei pozzi corrispondenti alla disposizione desiderata del sito di reazione.
3. Trasferire 40 nL (equivalenti a 2,2 pmol sgRNA) della miscela guida-PGA a ciascuna regione di spotting target del substrato DMF utilizzando un dispenser acustico calibrato.
   NOTA: A 55,6 pmol/μL, 40 nL fornisce 2,2 pmol sgRNA per sito (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Le guide essiccate vengono ricostituite durante la fusione delle gocce sulla cartuccia; La risospensione completa è confermata dall'efficienza di editing costante tra i siti.
4. In un armadietto di sicurezza biologica, lascia asciugare completamente le goccioline a temperatura ambiente finché non rimane liquido visibile (circa 5 minuti).
   NOTA: Non usare flusso d'aria forzato o calore, poiché ciò potrebbe spostare o degradare l'RNA guida.
5. Assembla la cartuccia DMF.
   1. In un armadietto di sicurezza biologica, allinea la piastra superiore sul substrato maculato abbinando le caratteristiche di scatto plastico asimmetrico della piastra superiore con le tacche sulla piastra inferiore. Applicare una pressione uniforme e simultanea lungo i bordi corti finché non si avverte uno scatto meccanico distinto, confermando l'innesto completo delle caratteristiche di bloccaggio.
      NOTA: La cartuccia è progettata con un unico orientamento corretto; un assemblaggio errato non produrrà lo schiocco. Tieni sempre i substrati ai bordi per evitare contaminazioni o danni alle superfici funzionali ed evita che i substrati scivolino l'uno contro l'altro, poiché ciò potrebbe graffiare i rivestimenti superficiali.
   2. Checkpoint: Conferma il corretto assemblaggio con il bottone meccanico.
      NOTA: Non esiste un indicatore elettrico pre-run dell'integrità del rivestimento; qualsiasi guasto funzionale dovuto a un assemblaggio improprio viene rilevato automaticamente e riportato nel rapporto QC post-esecuzione.
      Punto di pausa: conservare le cartucce assemblate inutilizzate in un pacchetto sigillato con essiccante (bustine di gel di silice) a temperatura ambiente fino a 48 ore.

3. Preparazione delle celle

1. Prepara 1 mL di tampone di trasfezione completa prima di ogni utilizzo combinando il tampone di elettroporazione compatibile con DMF con il tensioattivo biocompatibile non ionico fornito in un rapporto 20:1 (v/v) (tampone di elettroporazione: tensioattivo), ottenendo una concentrazione finale di tensioattivo dello 0,05% (v/v). Mescola delicatamente e lascia con ghiaccio.
   NOTA: Il buffer di trasfezione compatibile con DMF utilizzato qui è un buffer isotonico a bassa conducibilità (conducibilità: 3,5 mS/cm, osmolalità: 305 mOsm/L). I ricercatori che utilizzano buffer alternativi dovrebbero verificare la compatibilità con l'attuazione del DMF e la vitalità delle celle. Il tensioattivo non ionico biocompatibile serve a ridurre il bloccaggio delle gocce; se il tensioattivo fornito non viene utilizzato, un sostituto adatto.
2. Lavare le cellule T attivate una volta con il tampone di trasfezione (senza tensioattivo). Centrifugare a 180 × g per 5 minuti, aspirare il surnatante e risospendere la pellet cellulare in un tampone di trasfezione completa (contenente tensioattivo) a 1,0 × 10⁷ cellule/mL in un volume totale di 100 μL per cartuccia. Tieni il ghiaccio.
3. Immediatamente prima di caricarla sulla cartuccia, aggiungere nucleasi Cas9 direttamente ai 100 μL di sospensione a cellule T e mescolare con una pipettura delicata; Tieni il ghiaccio.
   NOTA: Per le cellule T primarie, Cas9 è caricato a 42 pmol per volume di cartuccia da 100 μL (0,42 pmol/μL). Ogni sito di elettroporazione processa circa 1 μL di sospensione della cella, fornendo 0,42 pmol Cas9 per montaggio. Ottimizzare questo dosaggio quando si adatta ad altri tipi di cellule immunitarie (vedi Tabella 1).

Componente	Concentrazione finale per modifica
Cas9	0,42 pmol in ~1 μL goccia
sgRNA	2.1 PMOL (da 40 nL spot)
PGA	44,4 mg/mL di brodo in miscela per la magazzina
Tensioattivo	0,05% (v/v)
Ingresso della cella	~10.000 celle

Tabella 1: Tabella riassuntiva delle concentrazioni finali in ciascuna goccia di trasfezione.

4. Trasfezione sulla piattaforma DMF-ection

1. Utilizzando una pipetta multicanale, dispensare 10 μL della miscela T-cell/Cas9 in ciascuna delle 8 porte di carico delle celle e 10 μL di tampone di trasfezione completa nelle 16 porte di carico degli elettrodi liquidi (come mostrato nella Figura 1).
2. Imposta la tensione a 500 V, la durata dell'impulso a 3 ms e il numero di impulsi a 2. Avvia la sequenza di elettroporazione secondo le istruzioni della piattaforma.
   1. Checkpoint: Rivedi il rapporto QC post-run immediatamente dopo la corsa. I guasti sporadici (<10% dei siti) non richiedono alcun intervento. Se i guasti sono sistematici, sostituisci la cartuccia con la scheda QC fornita, esegui il controllo di salute del sistema (~2 min) e contatta il supporto tecnico se persistono problemi.

5. Scarica e recupero delle cellule T modificate

1. Utilizzando un handler di liquidi, trasferire le celle elettroporate da ciascun sito di reazione in una piastra U-bottom di 96 pozzi contenente 150 μL di mezzo basale per cellule T preriscaldate, integrato con 200 IU/mL di IL-2.
2. Incubare le cellule per 72 ore a 37 °C, 5% di CO₂ per permettere il ricambio proteico e i cambiamenti nell'espressione dei recettori superficiali.

6. Analisi citometrica a flusso del knockout TRAC

1. Trasferire le cellule su una piastra inferiore sterile a 96 pozzi conici per ridurre la perdita cellulare tra un lavaggio e l'altro. Lava le cellule due volte con il Flow Cytometry Buffer (1× PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) centrifugando a 400 × g per 5 minuti e rimuovendo il sovrantantante invertendo delicatamente la piastra conica inferiore. Le cellule rimarranno bloccate nella placca.
2. Prepara un master mix per colorazione superficiale contenente anticorpi anti-CD4, anti-CD8 e anti-TCRα/β in Flow Cytometry Buffer alle concentrazioni raccomandate dal produttore. Aggiungi 25 μL di miscela master per pozzo e incuba per 20 minuti a 4 °C protetto dalla luce. Lava due volte con 1× di PBS (senza FBS) centrifugando a 400 × g per 5 minuti. Risospendere le cellule in 100 μL di PBS 1× contenente un colorante di vitalità a 1:1.000 (v/v) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce.
   NOTA: Le piastre coniche inferiori sono efficaci nel pelletare le cellule; Controlla che le cellule siano ben sospese in tutti i passaggi.
3. Lavare le cellule due volte con il tampone di citometria a flusso e risospendere in 150–200 μL per campione per l'acquisizione.
4. Configurare il citometro con linee laser appropriate e set di filtri per i fluorocromi utilizzati (ad esempio, eccitazione a 488 nm per coloranti di vitalità; 405 nm o 488 nm per marcatori superficiali a seconda di caso). Imposta le tensioni usando controlli di compensazione a singola colorazione e un campione non colorato. Raccogliere almeno 5.000 eventi live con singoletti per campione. Gate sequenzialmente su: singole scatter → cellule vive (colorante di vitalità negativa) → CD4⁺ o CD8⁺ → espressione TCRα/β.
   NOTA: In condizioni standard, il totale degli eventi vivi acquisiti può variare da 5.000 a oltre 10.000 per campione dopo perdite durante lavaggio e colorazione, dato che le cellule hanno avuto tempo per proliferare.
5. Determinare la disgregazione del gene TRAC misurando la frequenza delle cellule TCRα/β-negative all'interno delle popolazioni CD4⁺ e CD8⁺. Riporta l'efficienza del knockout come percentuale di celle TCRα/β-negative rispetto al singolo gate vivo per ciascun sottoinsieme.

Risultati

Risultati attesi
L'elettroporazione di 10.000 cellule T attivate per ogni condizione porta tipicamente a un'efficienza di knockout TRAC dell'>85% con >95% di vitalità 72 ore dopo la trasfezione. La citometria a flusso rivela una chiara perdita di colorazione TCRα/β nella condizione di targeting TRAC rispetto ai controlli sgRNA (NTC) non targetting e ai controlli non esposti a campi elettrici. Salvo diversa indicazione, n rappresenta le corse di DMF-ection ind...

Discussione

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro microfluidico microfluidico miniaturizzato che consente una consegna intracellulare efficiente nelle cellule T primarie umane utilizzando gocce a scala nanolitro. Un vantaggio centrale di questo metodo è la capacità di eseguire l'editing genomico CRISPR–Cas9 utilizzando solo 10.000 celle per reazione, riducendo drasticamente i requisiti di materiale rispetto all'elettroporazione convenzionale. L'architettura basata sulle gocce supporta l'aut...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Strumentazione
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Protocollo sferi
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Protocollo sferi
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Strumentazione
DMEM Media	Gibco	10564011	Media Supplement- Coltura sferi
DMF compatible buffer	DropGenie		Trasfezione
DropGenie Transfection System	DropGenie		Strumentazione
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Strumentazione
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media Supplement- Coltura sferi
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Strumentazione
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Protocollo sferi
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	Supplemento media per cellule T
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Sangue periferico, crioconservato, cellule T Helper pan CD3+, negativamente selezionate
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	Media per l'attivazione delle cellule T
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	Media per l'attivazione delle cellule T
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Strumentazione
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Strumentazione
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Media Supplement- Coltura sferi
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Usare a 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Protocollo sferi
Surfactant F	DropGenie		Trasfezione- usare a 1:20 nel buffer DMF compatibile per preparare il buffer di trasfezione completo
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Protocollo sferi