Articolo di ricerca

Effetti della regolazione dell'espressione di SPRY2 e miR-590-5p sull'autofagia nei condrociti modello di osteoartrite umana

DOI:

10.3791/70883

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31 luglio 2026

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1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, 2Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Lo stress infiammatorio in un modello di condrociti C28/I2 indotto da IL-1β ha aumentato miR-590-5p e ridotto l'espressione di SPRY2. La modulazione di questo asse ha alterato l'espressione di Beclin-1, LC3-II e Bcl-2, suggerendo una possibile via regolatoria miR-590-5p/SPRY2 che potrebbe influenzare le risposte associate all'autofagia e la sopravvivenza dei condrociti nell'osteoartrite.

Abstract

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L'osteoartrite (OA) è una malattia degenerativa articolare diffusa caratterizzata da una progressiva distruzione della cartilagine e dalla perdita dell'omeostasi dei condrociti. Sebbene l'autofagia disregolata contribuisca alla patogenesi dell'OA, i meccanismi molecolari che governano le risposte associate all'autofagia nei condrociti rimangono incompletamente compresi. Questo studio ha indagato il ruolo dell'asse regolatore miR-590-5p/SPRY2 in un microambiente infiammatorio di OA utilizzando condrociti umani C28/I2 indotti da IL-1β. Un modello OA in vitro è stato stabilito trattando le cellule C28/I2 con IL-1β. L'espressione di miR-590-5p e SPRY2 è stata valutata utilizzando PCR quantitativa e Western blotting. Sono stati impiegati approcci di guadagno e perdita di funzione per valutare gli effetti di SPRY2 e miR-590-5p sui marcatori associati all'autofagia Beclin-1 e LC3-II, così come sulla proteina correlata alla sopravvivenza Bcl-2. Analisi bioinformatiche ed esperimenti di salvataggio sono stati utilizzati per indagare la relazione regolatoria tra miR-590-5p e SPRY2. Il trattamento con IL-1β ha aumentato significativamente l'espressione di miR-590-5p riducendo al contempo i livelli di mRNA e proteine SPRY2 (P < 0,05). La sovraespressione di SPRY2 ha ridotto notevolmente l'espressione di Beclin-1 e LC3-II, con riduzioni rispettivamente di circa il 65% e il 77% (P < 0,05). Al contrario, la sovraespressione di miR-590-5p ha aumentato l'espressione di Beclin-1, LC3-II e Bcl-2, mentre l'inibizione di miR-590-5p ha invertito questi effetti e ripristinato l'espressione di SPRY2. Le analisi funzionali supportavano SPRY2 come possibile obiettivo regolatorio a valle del miR-590-5p. Questi risultati identificano l'asse miR-590-5p/SPRY2 come un importante regolatore dell'espressione dei marcatori associati all'autofagia e della sopravvivenza dei condrociti in condizioni infiammatorie, suggerendo la sua potenziale rilevanza come bersaglio terapeutico nell'OA.

Introduzione

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Essendo la forma di artrite più diffusa a livello mondiale, l'osteoartrite (OA) è una delle principali cause di dolore, disabilità della mobilità e disabilità fisica, imponendo un onere significativo ai sistemi sanitari e allasocietà 1. Patologicamente, l'OA è caratterizzata da progressiva degenerazione della cartilagine articolare, infiammazione sinoviale e rimodellamento patologico dell'ossosottocondrale 1. Le stime epidemiologiche indicano che circa 303 milioni di persone nel mondo sono colpite dall'OA, e questo numero dovrebbe aumentare con l'invecchiamento della popolazione e l'aumento dei tassi diobesità 2. In Cina, la prevalenza dell'OA sintomatica al ginocchio è stimata all'8,1%, con una prevalenza sproporzionatamente più alta tra donne e popolazionirurali 3. Nonostante l'alta prevalenza, le opzioni di trattamento attuali rimangono in gran parte limitate alla gestione dei sintomi tramite farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) e interventi chirurgici per la malattiaavanzata 4. L'assenza di farmaci modificanti per l'osteoartrite (DMOAD) riflette una comprensione incompleta dei meccanismi molecolari che regolano l'omeostasi e la sopravvivenza deicondrociti 5.

L'integrità strutturale e funzionale della cartilagine articolare dipende dai condrociti residenti, che mantengono il ricambio della matrice extracellulare (ECM) attraverso un equilibrio tra attività anaboliche ecataboliche 6. Durante la progressione dell'OA, i condrociti sono esposti a stress meccanico anomalo e a mediatori pro-infiammatori, in particolare interleuchina-1β (IL-1 β) e fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), che favoriscono uno spostamento dalla sintesi matriciale alla degradazionematriciale 6. L'IL-1 β contribuisce alla distruzione della cartilagine stimolando la produzione di metalloproteinasi della matrice (MMP) e aggrecanasi, sopprimendo la sintesi di collagene di tipo II eproteoglicani 7. Inoltre, l'IL-1β induce stress ossidativo e disfunzione mitocondriale, portando all'apoptosi dei condrociti ealla senescenza 8. Di conseguenza, identificare vie di segnalazione intracellulare che regolano la sopravvivenza dei condrociti in condizioni infiammatorie rimane una priorità per la ricerca sull'OA.

L'autofagia è una via di degradazione lisosomica conservata evolutivamente che mantiene l'omeostasi cellulare attraverso la rimozione e il riciclo di organelli danneggiati e aggregatiproteici 9. L'autofagia basale è essenziale per la sopravvivenza cellulare e l'equilibrio energetico; tuttavia, una disregolazione dell'autofagia può contribuire alla progressione dellamalattia 9. Nell'OA, l'autofagia è generalmente considerata una risposta protettiva che aiuta i condrociti ad adattarsi allo stress cellulare e a resistere all'apoptosi10. Studi precedenti hanno suggerito che l'attività autofagica diminuisce durante la progressione dell'OA, in particolare nelle malattie in stadio avanzato, causando un controllo cellulare della qualità compromesso e una maggiore perdita dicondrociti 11. Diverse proteine sono comunemente utilizzate come indicatori dell'attività associata all'autofagia. Beclin-1 partecipa all'inizio degli autofagosomi, mentre la conversione della proteina 1 associata ai microtubuli della catena leggera 3 (LC3-I in LC3-II) è ampiamente utilizzata come indicatore della formazionedell'autofagosoma 12. Al contrario, il linfoma a cellule B 2 (Bcl-2) inibisce l'autofagia dipendente da Beclin-1 esercitando anche effetti anti-apoptotici13. Tuttavia, l'interpretazione dei marcatori associati all'autofagia richiede cautela perché le misurazioni statiche di LC3-II e Beclin-1 non possono distinguere in modo indipendente la formazione aumentata di autofagosomi dalla degradazione lisosomale compromessa. Nonostante queste limitazioni, la modulazione delle vie correlate all'autofagia rimane una strategia terapeutica promettente per l'OA.

I microRNA (miRNA) sono RNA brevi e non codificanti che regolano l'espressione genica post-trascrizionale legandosi a sequenze complementari all'interno delle regioni 3′-non tradotte (3′-UTR) degli RNA messaggeri bersaglio, causando degradazione o repressione traslazionaledell'mRNA 14. L'espressione aberrante di miRNA è stata implicata nella patogenesi dell'OA attraverso effetti su infiammazione, apoptosi e rimodellamentoECM 15. Tra queste molecole, il miR-590-5p ha attirato l'attenzione per i suoi ruoli regolatori nel metabolismo osseo e in altri processi patologici. Studi precedenti hanno dimostrato che miR-590-5p promuove la differenziazione osteogenica e sopprime l'adipogenesi nelle cellule staminalimesenchimali 16. Nei modelli oncologici, il miR-590-5p presenta funzioni dipendenti dal contesto come regolatore oncogenico o soppressoredel tumore 17. Inoltre, profili alterati di espressione di microRNA, inclusi membri della famiglia miR-590, sono stati implicati nella rimodellazione patologica dei tessuti articolari durantel'OA 18. Tuttavia, le evidenze ottenute da modelli di cellule staminali o tumorali non possono essere estrapolate direttamente ai condrociti articolari maturi. Pertanto, il ruolo di miR-590-5p nella regolazione delle risposte dei condrociti all'interno del microambiente infiammatorio dell'OA rimane incompletamente compreso.

Per indagare i potenziali meccanismi a valle del miR-590-5p nell'OA, sono state effettuate analisi di previsione dei bersagli in silico , identificando Spro/Sproty2 (SPRY2) come possibile bersaglio a valle. SPRY2 appartiene alla famiglia di proteine Sprouty, che regolano negativamente la segnalazione della tirosina chinasi recettore e sopprimono l'attivazione della via RAS/MAPK/ERK 19. Poiché la segnalazione MAPK influenza la differenziazione dei condrociti, le risposte infiammatorie e l'autofagia, SPRY2 può rappresentare un importante nodo regolatore nella fisiopatologiadell'OA 20. Studi precedenti indicano che SPRY2 può sopprimere le risposte infiammatorie nei modelli di artritereumatoide 21, partecipare alla regolazione correlata all'apoptosi nei sistemiepiteliali 22 ed è associato a risposte legate all'autofagia nei modelli di lesioni ischemiche23. Sebbene queste osservazioni suggeriscano che SPRY2 partecipi alla regolazione sia dell'apoptosi che dell'autofagia, il suo ruolo nei condrociti articolari rimane poco caratterizzato. È stato quindi ipotizzato che miR-590-5p e SPRY2 costituiscano un asse regolatore che influenza la sopravvivenza dei condrociti sotto stress infiammatorio.

Sulla base di queste osservazioni, è stato proposto che miR-590-5p moduli le risposte associate all'autofagia nei condrociti regolando l'espressione di SPRY2. Sebbene miR-590-5p e SPRY2 siano stati studiati individualmente in altri contesti biologici, la loro relazione funzionale nei condrociti OA non è stata stabilita. Nel presente studio, un modello OA indotto da IL-1β in condrociti umani C28/I2 è stato utilizzato per esaminare i modelli di espressione di miR-590-5p e SPRY2 e per valutarne gli effetti sull'espressione di Beclin-1, LC3-II e Bcl-2. Indagando l'asse regolatorio miR-590-5p/SPRY2, questo studio fornisce una comprensione dei meccanismi epigenetici alla base della sopravvivenza dei condrociti e identifica un potenziale bersaglio terapeutico per l'OA.

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Protocollo

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Questo studio è stato condotto esclusivamente utilizzando la linea cellulare di condrociti umani C28/I2, disponibile in commercio. Nessun partecipante umano, campioni di tessuto umano, materiali derivati dal paziente o animali vivi sono stati coinvolti in questa ricerca. Pertanto, l'approvazione dell'Institutional Review Board (IRB) e dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) non erano richieste in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali. Gli strumenti, i prodotti chimici, i kit e i reagenti utilizzati nel protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Coltura cellulare e costruzione di modelli OA

La linea cellulare di condrociti umani C28/I2 (dettagli forniti nella Tabella dei Materiali) è stata ottenuta da un fornitore commerciale. Per garantire la riproducibilità sperimentale, le cellule sono state autenticate tramite profilazione a breve ripetizione tandem (STR) e testate regolarmente per confermare l'assenza di contaminazione da micoplasmi. Le celle tra i passaggi 3 e 8 sono state utilizzate per tutti gli esperimenti. Le cellule sono state mantenute nel DMEM integrate con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina (tutti i reagenti di coltura sono dettagliati nella Tabella dei Materiali) a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% diCO2.

Per stabilire il modello in vitro dell'osteoartrite (OA), le cellule C28/I2 sono state stimolate con IL-1β umano ricombinante. Sulla base della letteraturaconsolidata 6,7, esperimenti preliminari di ottimizzazione dose-risposta progettati per indurre uno stato catabolico robusto senza eccessiva citotossicità immediata, le cellule sono state trattate con 20 ng/mL di IL-1β per 24 ore.

2. Raggruppamento sperimentale e trasfezione

Per chiarire le vie meccanicistiche, lo studio è stato suddiviso in tre principali moduli sperimentali, ciascuno con almeno tre repliche biologiche indipendenti:

  1. Guadagno/Perdita di funzione SPRY2:
    Le cellule furono assegnate a Controllo, modello OA, OA + vettore vuoto (NC), plasma di sovraespressione OA + SPRY2 (OE-SPRY2) e corrispondenti piccoli gruppi RNA interferenti (si-NC e tre costrutti specifici si-SPRY2: si-695, si-800, si-896) per verificare l'efficienza delle interferenze.
  2. Modulazione miR-590-5p:
    Le cellule sono state suddivise in gruppi Controllo, modello OA, OA + mimica NC, OA + miR-590-5p mimetico, OA + inibitore NC e OA + miR-590-5p inibitori.
  3. Validazione funzionale della relazione regolatoria miR-590-5p/SPRY2:
    Per valutare ulteriormente la relazione regolatoria proposta tra miR-590-5p e SPRY2, le cellule sono state sottoposte a condizioni miMiche e inibitrici di miR-590-5p per determinare se la modulazione miR-590-5p alterasse l'espressione di SPRY2 nel modello OA.
    Per la trasfezione, le cellule C28/I2 sono state seminate in piastre a 6 pozzi a 2 × 105 celle per pozzo. Al raggiungimento della confluenza del 70%–80%, le trasfezioni sono state eseguite utilizzando un reagente commerciale a base di lipidi secondo il protocollo del produttore e procedure stabilite per la somministrazione di piccoli RNA neicondrociti 24. Per un breve periodo, plasmidi (OE-SPRY2 e NC; 2 μg/pozzo) e oligonucleotidi (miR-590-5p mimic/inibitore e siRNA; 50 nM) sono stati diluiti in un mezzo siero ridotti. I complessi lipidi-DNA/RNA sono stati incubati a temperatura ambiente per 15 minuti prima di essere aggiunti a goccia alle cellule in DMEM senza siero. A 6 ore dalla trasfezione, il mezzo veniva sostituito con DMEM completo contenente il 10% di FBS, e le cellule venivano coltivate per ulteriori 48 ore prima dell'estrazione di RNA e proteine.

3. rilevamento qPCR

L'RNA totale e il miRNA sono stati isolati utilizzando un kit dedicato di estrazione dei miRNA secondo il protocollo del produttore. La purezza e la concentrazione di RNA sono state valutate utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis, e campioni con rapporti A260/A280 di 1,8–2,0 sono stati utilizzati per analisi a valle. Reagenti commerciali a trascrizione inversa venivano utilizzati per sintetizzare cDNA. La procedura di ciclaggio qPCR è stata la seguente: 95 °C per 10 minuti; 40 cicli a 95 °C per 10 s, 58 °C per 30 s e 72 °C per 30 s; seguita dall'analisi della curva di fusione per verificare la specificità dell'innesto e l'assenza di dimeri insettori. β-actina e U6 servivano rispettivamente come controlli interni per mRNA e miRNA. L'espressione genica relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCt 25. Tutte le sequenze di innesco, incluse quelle per Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p e geni di riferimento, sono elencate nella Tabella 1.

Nome di guida Primer anteriore (5′-3′)Primer inverso (5′-3′)
U6ATTGGAACGATACAGAAGATTGGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5pGCGTAAGGCACGCGGTGAGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-actinTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCCCCCTAGAAGCA
SPRY2TAAGCCACTGAGCAAGGAAGATTGGAAGGTAACACCATAAAAAGG
Bcl-2TGGGATTCCTGCGGATTGACTCAGTCTACTTCCTCTGTGATGTTG
Beclin-1TCCCGTGGAATGGAATGAGAGTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTCTG
LC3-IICATCCAACCAAAATCCCGGTGAGCTGTAAGCGCCTTTTTTAA

Tabella 1: Sequenze di primer utilizzate per l'analisi quantitativa PCR (qPCR). Sequenze di primer forward e back utilizzate per l'amplificazione e quantificazione dei trascritti target e i controlli interni di riferimento tramite qPCR.

Salvo diversa specificazione, i dati sono espressi come deviazione media ± standard (SD). La significatività statistica è stata determinata utilizzando ANOVA unidirezionale seguita dal test post hoc S-N-K. I simboli indicano: *P < 0,05 vs. Control; #P < 0,05 rispetto al modello indicato o al gruppo di controllo negativo; &P < 0,05 vs. OA+Inibitore-NC.

4. Rilevamento del western blot

Le cellule sono state prelevate e lisate utilizzando un tampone RIPA integrato con cocktail di proteasi e inibitori della fosfatasi, seguendo procedure consolidate di estrazione proteica e immunoblotting. Dopo la centrifugazione a 14.000 × g per 15 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari, il soprantantante è stato raccolto e le concentrazioni proteiche sono state quantificate utilizzando un kit di analisi proteica BCA. Quantità uguali di lisato proteico (30 μg) sono state denaturate, risolte da SDS-PAGE per 1,5 ore e trasferite sulle membrane PVDF a 300 mA per 1,5 oree 26. Le membrane sono state bloccate con latte secco al 5% di scremito in soluzione salina Tween 20 (TBST) con tampone tris-buffer contenente 0,1% Tween 20 (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente, seguita da incubazione a 4 °C per 16 ore con anticorpi primari specifici (ad esempio, anti-SPRY2, diluizione 1:1000). Dopo tre lavaggi in TBST, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con HRP appropriati a temperatura ambiente per 2 ore. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un sistema di rilevamento ECL e quantificate tramite il software ImageJ.

5. Analisi statistica

I dati sono stati analizzati utilizzando software di analisi statistica. Tutti gli esperimenti sono stati condotti con almeno tre repliche biologiche indipendenti (n ≥ 3), e i dati quantitativi sono presentati come la media ± deviazione standard (SD). Prima dei test parametrici, la normalità dei dati veniva valutata utilizzando il test di Shapiro-Wilk e veniva misurata l'omogeneità della varianza. La significatività statistica tra più gruppi è stata valutata utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA), seguita dal test post hoc Student-Newman-Keuls (S-N-K) per confronti multipli. P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

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Stabilimento del modello infiammatorio dei condrociti in vitro

Per indagare i meccanismi molecolari alla base della patologia dell'osteoartrite, è stato stabilito un modello infiammatorio in vitro utilizzando condrociti umani C28/I2 stimolati con IL-1β. La validità di questo modello è stata confermata valutando l'espressione della catena alfa-1 di tipo II (Col-II), componente principale della matrice extracellulare della cartilagine i...

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Discussione

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Studi precedenti hanno dimostrato che i miRNA regolano l'autofagia in molteplici stadi, inclusi l'inizio, l'allungamento della vescicola ela maturazione 27. Il coinvolgimento dei miRNA nella patogenesi dell'OA è stato sempre più documentato, in particolare attraverso effetti su infiammazione, apoptosi, rimodellamento della matrice extracellulare e vie correlate all'autofagia. miR-590-5p è stato collegato all'omeostasi cellulare e ai processi associati al

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano il Dipartimento di Geriatria dell'Ospedale Ruikang, Università di Medicina Cinese del Guangxi, per aver fornito strutture sperimentali e supporto tecnico per questo studio. Gli autori ringraziano inoltre il personale di laboratorio e i colleghi per l'aiuto nella raccolta e analisi dei dati. Questo lavoro è stato supportato dal Progetto di Ricerca sulle Scienze Naturali dell'Università di Medicina Cinese del Guangxi (Grant n. 2022MS039; LncRNA-GAS5 media l'espressione di SPRY2 per inibire l'autofagia nei condrociti OA del ginocchio del topo: studio del meccanismo e effetto dell'intervento precoce della prescrizione Huayu Qushi) e la National Natural Science Foundation of China (Regional Foundation) (Grant n. 82160912; Discussione sul meccanismo sulla degradazione dell'ubiquitinazione di Skp2, l'inibizione di FoxO1, l'inibizione dell'autofagia dell'OA al ginocchio e l'effetto dell'intervento precoce della prescrizione di Huayu Qushi.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anti-β-actin antibodyProteintech66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938Controllo di carico interno per l'analisi Western blot
Anti-SPRY2 antibodyProteintech11383-1-AP ; RRID: AB_2196324Rilevamento dell'espressione proteica SPRY2
Kit per dosaggio proteico BCAThermo Fisher Scientific23225Determinazione della concentrazione totale delle proteine
Linea cellulare di condrociti umani C28/I2PunocelCP-H107Modello in vitro di condrociti per studi sull'osteoartrite
DMEM completoKeyGen BiotecKGM12800SMezzo basale per la coltura cellulare di routine
Kit CWBIO per l'estrazione di miRNA ultrapuriCWBIOCW0627SIsolamento di RNA totale e miRNA
Sistema di rilevamento ECLThermo Fisher Scientific32106Visualizzazione chemiluminescente delle bande proteiche
Siero fetale bovino (FBS)Gibco1891605Supplemento di crescita per la coltura cellulare
GraphPad Prism versione 9.0GraphPad SoftwareN/AAnalisi statistica e generazione di grafici
HiScript II Q RT SuperMixVazymeR223-01Trascrittura inversa dell'mRNA in cDNA
Software ImageJNational Institutes of HealthN/AQuantificazione dell'intensità delle bande Western blot
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015Trasfezione di plasmidi e oligonucleotidi
miR-590-5p mimic, inibitore e NCRiboBioSintetizzati su misuraModulazione dell'espressione miR-590-5p
Kit per la sintesi del primo filamento di cDNA di miRNAVazymeMR101-02Trascrittura inversa del miRNA in cDNA
Mezzo Opti-MEMGibco31985-062Preparazione di complessi di trasfezione
Penicillina-streptomicinaGibco15140122Prevenzione della contaminazione batterica nella coltura cellulare
Cocktail di inibitori di proteasi e fosfatasiMedChemExpressHY-K0010Protezione delle proteine durante l'estrazione
Membrane PVDFMillipore SigmaISEQ00010Membrane per il trasferimento di proteine per immunoblotting
IL-1β umana ricombinanteMedChemExpressHY-P78459Induzione di condizioni infiammatorie simili all'OA
Buffer RIPABeyotimeP0013BLisis cellulare ed estrazione delle proteine
Costrutti si-SPRY2 e si-NCGenePharmaSintetizzati su misuraSilenziamento dell'espressione di SPRY2
Plasmid di sovraespressione SPRY2 (OE) e vettore vuoto (NC)GeneChemCostruiti su misuraValutazione degli effetti della sovraespressione di SPRY2
Spettrofotometro UV-VIS (NanoDrop 2000)Thermo Fisher ScientificND-2000Misurazione della concentrazione e della purezza dell'RNA

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hunter DJ, Bierma-Zeinstra S. Osteoarthritis. Lancet. 2019;393:1745-59.
  2. GBD 2019 Diseases and Injuries Collaborators. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 2020;396:1204-22.
  3. Tang X, et al. The prevalence of symptomatic knee osteoarthritis in China: Results from the China Health and Retirement Longitudinal Study. Arthritis Rheumatol. 2016;68:648-53.
  4. Latourte A, Kloppenburg M, Richette P. Emerging pharmaceutical therapies for osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2020;16:673-88.
  5. Glyn-Jones S, et al. Osteoarthritis. Lancet. 2015;386:376-87.
  6. Kapoor M, et al. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:33-42.
  7. Goldring MB, Otero M. Inflammation in osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol. 2011;23:471-8.
  8. Lepetsos P, Papavassiliou AG. ROS/oxidative stress signaling in osteoarthritis. Biochim Biophys Acta. 2016;1862:576-91.
  9. Mizushima N, Komatsu M. Autophagy: Renovation of cells and tissues. Cell. 2011;147:728-41.
  10. Caramés B, Olmer M, Kiosses WB, Lotz MK. The relationship of autophagy defects to cartilage damage during joint aging in a mouse model. Arthritis Rheumatol. 2015;67:1568-76.
  11. Lotz MK, Caramés B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:579-87.
  12. Kabeya Y, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 2000;19:5720-8.
  13. Pattingre S, et al. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy. Cell. 2005;122:927-39.
  14. Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004;116:281-97.
  15. Miyaki S, Asahara H. Macro view of microRNA function in osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2012;8:543-52.
  16. Wu Z, Lin Y, Zhang Z, Pan Y. Melatonin-mediated miR-526b-3p and miR-590-5p upregulation promotes chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Pineal Res. 2018;65:e12483.
  17. Chen M, Wang S, Chen Y. miR-590-5p suppresses hepatocellular carcinoma chemoresistance by targeting YAP1 expression. EBioMedicine. 2018;35:142-54.
  18. Endisha H, Rockel J, Jurisica I, Kapoor M. The complex landscape of microRNAs in articular cartilage: biology, pathology, and therapeutic targets. JCI Insight. 2018;3:e98630.
  19. Guy GR, Jackson RA, Yusoff P, Chow SY. Sprouty proteins: Modified modulators, matchmakers or missing links? J Endocrinol. 2009;203:191-202.
  20. Loeser RF. Integrins and chondrocyte-matrix interactions in articular cartilage. Matrix Biol. 2014;39:11-6.
  21. Zhang W, Chen L, Xiong Y. Intraarticular gene transfer of SPRY2 suppresses adjuvant-induced arthritis in rats. Appl Microbiol Biotechnol. 2015;99:6727-35.
  22. Liu Y, et al. MicroRNA-124 facilitates lens epithelial cell apoptosis by inhibiting SPRY2 and MMP-2. Mol Med Rep. 2021;23:381.
  23. Wu Y, Gao Z, Zhang J. Transcription factor E2F1 aggravates neurological injury in ischemic stroke via microRNA-122-targeted Sprouty2. Neuropsychiatr Dis Treat. 2020;16:2633-47.
  24. Jiang P, Zheng Z, Tang Y. miR-590-5p affects chondrocyte proliferation, apoptosis, and inflammation by targeting FGF18 in osteoarthritis. Am J Transl Res. 2021;13:8728-41.
  25. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 2001;25:402-8.
  26. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:4350-4.
  27. Panagopoulos PK, Lambrou GI. The involvement of microRNAs in osteoarthritis and recent developments: A narrative review. Mediterr J Rheumatol. 2018;29:67-79.
  28. Barwal TS, Sharma P. miR-590-5p: A double-edged sword in the oncogenesis process. Cancer Treat Res Commun. 2022;32:100593.
  29. Mou K, Chen M. miR-590-5p inhibits tumor growth in malignant melanoma by suppressing YAP1 expression. Oncol Rep. 2018;40:2056-66.
  30. D'Adamo S, et al. Autophagy in osteoarthritis: a target for new therapies. Curr Rheumatol Rep. 2020;22:37.
  31. Agarwal V, Bell GW, Nam JW, Bartel DP. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 2015;4:e05005.
  32. Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 2009;19:92-105.
  33. Lee CC, et al. Overexpression of sprouty 2 inhibits HGF/SF-mediated cell growth, invasion, migration, and cytokinesis. Oncogene. 2004;23:5193-202.
  34. Frank MJ, et al. Expression of sprouty2 inhibits B-cell proliferation and is epigenetically silenced in mouse and human B-cell lymphomas. Blood. 2009;113:2478-87.
  35. Cui S, et al. Hsa-miR-22-3p inhibits liver cancer cell EMT and cell migration/invasion by indirectly regulating SPRY2. PLoS One. 2023;18:e0281536.

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