Un algoritmo di analisi della forma quantifica la morfologia spaziale e il contesto della coltura cellulare da 2D a 3D per una nuova quantificazione dei fenotipi

Sommario

Questo articolo spiega come nuove caratteristiche morfologiche in cellule e organoidi possano essere quantificate utilizzando la trasformata linearizzata delle coordinate polari compresse (LCPC), un algoritmo spaziale che cattura proprietà che metriche tradizionali, come area, volume e superficie superficiale, non possono essere. Vengono discusse le migliori pratiche per l'orientamento e l'allineamento della forma.

Abstract

Numerosi studi hanno dimostrato che il fenotipo morfologico di una cellula o di un organoide è correlato alla sua suscettibilità agli agenti anticancerosi. Tuttavia, i metodi tradizionali di misurazione del fenotipo si basano su metriche spaziali come area, volume, perimetro e intensità del segnale, che funzionano ma sono limitate. Questi approcci non possono misurare molte caratteristiche cruciali del contesto spaziale, come la chiralità, una proprietà della mancina e della destrorsità. Il volume non può essere usato per registrare la chiralità perché le scarpe sinistra e destra hanno lo stesso volume. Sebbene il contesto spaziale sotto forma di chiralità, direzione gravitazionale e asse di polarità sia intuitivo per gli esseri umani, le metriche tradizionali utilizzate da biologi cellulari, patologi, radiologi e operatori di apprendimento automatico fino ad oggi non riescono a catturare queste nozioni fondamentali. La trasformata linearizzata delle coordinate polari compresse (LCPC) è un algoritmo innovativo che può catturare il contesto spaziale come qualsiasi altra metrica. La trasformata LCPC traduce un contorno bidimensionale (2D) in un'onda sinusoidale discreta sovrapponendo un sistema a griglia che traccia i punti di intersezione tra il contorno e le linee della griglia. Trasforma il contorno in una sequenza di coppie di coordinate discrete, con la coordinata indipendente (coordinata x) corrispondente a posizioni consecutive nello spazio 2D. Ogni coordinata dipendente (coordinata y) consiste nella distanza tra un'intersezione tra il contorno e la linea della griglia e l'origine o la linea di base del sistema a griglia. Sotto forma di un'onda sinusoidale discreta, la Trasformata di Fourier Veloce viene quindi applicata ai dati. In questo modo, le forme delle cellule in colture 2D e 3D sono rappresentate in modo sistematico e multidimensionale, permettendo una robusta stratificazione quantitativa che rivelerà intuizioni sulla resistenza ai trattamenti.

Introduzione

La coltura organoide tridimensionale (3D) si è dimostrata superiore alla coltura cellulare bidimensionale (2D) nel simulare la biologia in vivo ^1,2. Gli organoidi sono diventati indispensabili nella ricerca sul cancro per lo screening di trattamenti efficaci e per ottenere informazioni sulla progressione della^malattia 3,4,5,6. Sebbene sia ben noto in biologia del cancro che le distinzioni morfologiche siano correlate a un comportamento biologico distinto di cellule e tessuti, il campo si basa su metriche di forma tradizionali che sono limitate nell'ambito. Questo studio descrive un innovativo algoritmo spaziale che quantifica oggettivamente le caratteristiche morfologiche sottili con precisione senza precedenti, superando approcci tradizionali come area, volume e superficie.

La trasformata delle coordinate polari compresse linearizzate (LCPC) è stata inventata per descrivere oggettivamente e quantitativamente morfologie complesse osservate in istopatologia tissutale, con l'obiettivo di migliorare la gradazione dei polipi del^{colon 7}. Il desiderio di poi ampliare questo approccio per catturare caratteristiche spaziali basate su risonanza magnetica macroscopica in patologie cerebrali, come il disturbo bipolare e il morbo di Alzheimer, ha portato ad aumenti che lo hanno ulteriormente potenziato. Questo studio descrive il protocollo passo dopo passo e le migliori pratiche per l'applicazione di due versioni della trasformata LCPC: il sistema a griglia parallela e il sistema a griglia radiale, entrambe con script open-source e video tutorial.

Oltre ai metodi geometrici tradizionali, esistono molteplici astrazioni che si sono rivelate efficaci per misurare le forme complesse di cellule e organi. Questi includono la misurazione di eccentricità, inclinazione, contrasto e curtosi, insieme ai momenti di Zernike per catturare circolarità, asimmetria, irregolarità dei bordi e struttura globale^{dei contorni 8,9,10}. L'analisi frattale è stata utile anche per ridurre contorni complessi in valori scalari, come la Dimensione Frattale, che misura quanto è irregolare il contorno, e la lacunarità, che misura quanto appaiono eterogeneamente irregolari i gap nel^{contorno 11,12}. Per misurare la texture, il metodo Gray Level Co-occurrence Matrix (GLCM) è popolare per misurare contrasto, energia, omogeneità, correlazione ed^{entropia 13,14}. Sebbene tutti questi metodi siano utili, nessuno di essi è stato progettato per catturare il contesto spaziale, come la direzione della gravità, la destrezza o la posizione della struttura di supporto centrale che influenza la direzione del cambio di forma. Inoltre, molti di essi producono un singolo valore scalare o solo una manciata di valori scalari per rappresentare informazioni spaziali, motivo per cui gli studi citati spesso li usano in combinazione per valutare forme complesse.

La trasformata LCPC è stata progettata per produrre molte caratteristiche da una sola misurazione e per permettere l'aggiunta di marcatori spaziali che codificano il contesto spaziale nella forma, come la direzione di gravità. Il metodo più vicino alla trasformata^{LCPC 7} fu pubblicato un anno dopo^{il 15}, condividendo la stessa idea centrale come punto di partenza: applicare la trasformata di Fourier ai contorni delle celle per misurare la forma sotto forma di uno spettro di frequenza. Tuttavia, la trasformata LCPC è stata sviluppata indipendentemente per essere applicata tramite sistemi a griglia distinti, pensati per essere utilizzati insieme alla conoscenza del contesto spaziale al di fuori della forma misurata. Inoltre, l'inventore della trasformata LCPC spiega in questo manoscritto che lo spettro di frequenze risultante contiene enormi quantità di informazioni spaziali nascoste. Il Supplementary File 1 contiene una discussione estesa sui contesti spaziali in biologia spesso trascurati quando si usano i metodi citati e su come la trasformata LCPC possa essere applicata per catturare questo contesto. Per i lettori i cui dati sulla forma non mostrano differenze tra gruppi di controllo e quelli sperimentali, se i loro occhi possono vedere una differenza nelle forme, o i cui dati sulla forma mostrano pochissima differenza, anche se sospettano che debba esserci una differenza maggiore, dovrebbero provare la trasformata LCPC.

La trasformata LCPC offre un livello di precisione senza precedenti nella misurazione delle informazioni spaziali perché rappresenta forme in molteplici dimensioni. A differenza dei metodi tradizionali, come area e volume, che producono un solo valore scalare per forma (cioè 25 cm²), i risultati della trasformata LCPC possono produrre indici multipli, ciascuno correlato a un aspetto morfologico diverso di una forma (cioè, rotondità vs. nitidezza degli angoli, levigatura vs. irregolarità degli spigoli). La trasformata LCPC descrive una forma 2D sovrapponendo una griglia di linee rette che ne intersecano il contorno. Ogni sistema a griglia ha un'origine (Figura 1) o una linea di base (Figura 2) da cui misurare la distanza lineare. Consulta le Figure 1B e 2B per diagrammi di flusso semplificati che descrivono l'algoritmo. Ogni punto di intersezione tra le linee della griglia e il contorno della forma viene rilevato. La distanza di ogni intersezione viene poi calcolata rispetto a una linea di base o origine. In questo modo, la trasformazione LCPC converte le forme 2D in una serie di coppie consecutive di coordinate x-y. La coordinata x rappresenta la posizione della linea della griglia da zero all'infinito, mentre la coordinata y rappresenta la distanza dell'intersezione dalla linea di base o dall'origine. In questa forma, che è un'onda sinusoide discreta, viene poi applicata la trasformata di Fourier Veloce (FFT) per convertire i dati dal "dominio della posizione" al dominio della frequenza. Se la coordinata x rappresentasse il tempo, allora il "dominio della posizione" sarebbe equivalente al "dominio del tempo" nelle applicazioni standard della FFT.

Mentre il sistema a griglia radiale misura la distanza di ogni intersezione dall'origine della griglia radiale (Figura 1A), il sistema a griglia parallela misura sempre la distanza delle intersezioni con riferimento a una linea immaginaria a sinistra della forma (Figura 2A). Lo script open-source determina la posizione di questa linea immaginaria trovando il pixel più a sinistra del contorno e poi spostando 10 pixel a sinistra di questa posizione. Qui, la coordinata x di questa posizione diventa la retta di riferimento da cui vengono calcolate tutte le intersezioni. Questa regola dei 10 pixel è arbitraria, ma è per questo che tutti i contorni analizzati dallo script open-source per il sistema a griglia parallela devono avere almeno 15 pixel di spazio bianco su tutti e quattro i lati.

Per forme 2D con pieghe o strati multipli, le linee di griglia possono intersecare il contorno più di una volta. In questo caso, le distanze di tutte le intersezioni lungo una griglia vengono sommate in un unico valore. Quindi, ogni linea di griglia ha una sola coordinata x e una coordinata y. Questa somma è rappresentata dal termine "compresso" nel nome trasformata LCPC. La rappresentazione di una forma 2D non lineare in un'onda sinusoide discreta è rappresentata dal termine "linearizzato" nel nome dell'algoritmo. Infine, il termine "coordinate polari" è nel nome dell'algoritmo perché il primo sistema a griglia concepito era una griglia radiale a 180 gradi di coordinate^{polari 7}. Anche dopo aver capito che le coordinate polari e cartesiane sono intercambiabili, il nome dell'algoritmo è rimasto così com'è. La sezione ringraziamenti descrive le ragioni personali che hanno motivato l'invenzione e l'aumento della trasformazione LCPC.

Il Protocollo 1 era la sequenza per ottenere i dati mostrati nella Figura 3B, mentre il Protocollo 2 era la sequenza per ottenere i dati mostrati nella Figura 3C–D. I passaggi di questi protocolli sono implementati in singoli script Python disponibili nel repository GitHub "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶. Il Protocollo 1 è un esempio dei passaggi di pre-elaborazione per derivare la "forma pura" in preparazione alla trasformata LCPC. Il Protocollo 2 è un esempio di passaggi di pre-elaborazione per misurare forme "in scala", cioè alle loro scale originali l'una rispetto all'altra.

La segmentazione può essere effettuata manualmente in software di elaborazione immagini, come Preview su Mac o Paint di Microsoft, oppure utilizzando metodi basati su soglia. Se fatto manualmente, si dovrebbe scegliere uno dei seguenti quattro colori: blu, verde, rosa/magenta o rosso. Il repository GitHub chiamato "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶ contiene una cartella chiamata "color extraction scripts". Questa cartella contiene quattro file Jupyter Notebook con codice Python che estraggono i quattro colori menzionati e li convertono in maschere blu su sfondo bianco. Questo processo può essere eseguito anche sogliando il colore del contorno in un software di elaborazione immagini come Fiji/ImageJ. Per le immagini che contengono contorni con bordi a contatto o bordi sovrapposti (ad esempio, un diagramma di Venn), dovranno essere separate tramite software di elaborazione delle immagini, in modo che diventino oggetti indipendenti nell'immagine composita a maschera contenente più contorni organoidi. Questo non si applica alle immagini che contengono un solo organoide o più organoidi che non si toccano tra loro.

Protocollo

Le cellule umane primarie utilizzate in questo studio sono state prelevate e coltivate secondo le approvazioni etiche e le procedure di consenso informato precedentemente^{riportate 17}. Le immagini presentate qui sono state generate da quelle colture cellulari approvate e sono state pubblicate per la prima volta. I campioni di tessuto sono stati raccolti presso il Brigham and Women's Hospital e l'Università della California, San Francisco, secondo protocolli approvati dall'Institutional Review Board (IRB), da pazienti che hanno fornito un consenso informato per l'uso in ricerca dei loro tessuti, come descritto^{in precedenza 17}. Non è stata effettuata alcuna raccolta aggiuntiva di esemplari umani per questo studio.

1. Estrazione della forma pura dei contorni organoidi 2D per la trasformata LCPC

1. Segmenta il bordo esterno di ogni organoide utilizzando qualsiasi software di elaborazione immagini, come Paint di Microsoft, Preview di MacOS o Fiji/ImageJ.
2. Estrarre i contorni degli organoidi come maschere aperte che sono linee blu su uno sfondo bianco.
3. Isola ogni contorno blu su una tela bianca a parte.
   NOTA: Questo passaggio è necessario solo se un'immagine contiene più di un contorno.
4. Ritaglia ogni contorno in modo che abbia un margine di un pixel su tutti e quattro i lati dell'oggetto blu.
5. Aggiungi 100 pixel di spazio bianco su tutti e quattro i lati per creare nuovi margini.
6. Ruota gli oggetti in modo che la lunghezza interna più lunga sia orizzontale.
   NOTA: Questo passaggio trasforma la linea interna più lunga all'interno di ogni oggetto nella larghezza dell'oggetto. Sono disponibili due copioni per questo scopo. Per forme chiuse, usa il Jupyter Notebook chiamato "Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb". Per forme aperte o con più componenti, usa il Jupyter Notebook chiamato "Rotate Green Line_v3.ipynb". Lo strumento Ruota la Linea Verde ha un tutorial video collegato nel file ReadMe contenuto nella stessa cartella del file .ipynb.
7. Ritaglia ogni immagine in modo che abbia un margine di un pixel su tutti e quattro i lati dell'oggetto blu.
   NOTA: Questo è lo stesso passo 1.4. Lo scopo del taglio questa volta, però, è che il passaggio di ridimensionamento successivo ridimensiona l'intera tela, non solo l'oggetto blu al suo interno. Così, rendendo l'oggetto blu quasi della stessa larghezza e altezza della tela stessa, ridimensionare la tela a 400 pixel di larghezza si ridimensiona anche l'oggetto fino a quasi 400 pixel. Esiste un Jupyter Notebook chiamato "Margine di taglio a bordo di 1-pixel.ipynb".
8. Ridimensionare la larghezza della tela di ogni immagine a 400 pixel, limitando anche il rapporto d'aspetto.
   NOTA: Questo passaggio fa sì che ogni oggetto abbia la stessa larghezza. Limitare il rapporto d'aspetto impedisce di distorcere l'oggetto durante il ridimensionamento. Esiste un Jupyter Notebook chiamato "Resize width to 400 pixel but limitare image ratio.ipynb".
9. Aggiungi 100 pixel di spazio bianco su tutti e quattro i lati per creare nuovi margini.
10. Ruota ogni immagine di 90 gradi in senso orario o antiorario per rendere verticale la lunghezza interna più lunga, seguendo la scelta per tutte le immagini.
    NOTA: Nella sequenza sopra, la forma pura si ottiene implementando sequenzialmente i Passaggi 1.6, 1.7, 1.8 e 1.9. Aggiungere spazio di margine nello Passo 1.9 è necessario per evitare errori negli script di trasformazione LCPC che verranno eseguiti successivamente, ma non è coinvolto nell'estrazione della forma pura. Gli utenti che desiderano misurare forme "in scala" non devono eseguire i Passaggi 1.6, 1.7 e 1.8 nella sequenza sopra, anche se dovrebbero comunque pre-elaborare le immagini della maschera per ottenere un'orientazione ottimale prima di applicare la trasformata LCPC.
11. Esegui la trasformata LCPC su ogni contorno. Usa script Python forniti per il metodo radiale^{grid 18} o il metodo parallel^{grid 19}.

2. Estrazione della forma in scala dei contorni organoidi 2D per la trasformata LCPC

NOTA: Il metodo passo dopo passo per estrarre la forma in scala degli oggetti è simile a quello per estrarre la forma pura nel Protocollo 1 sopra. I passaggi sono nominati allo stesso modo in entrambi i protocolli per facilitare l'abbinamento. Si prega di consultare le note nel Protocollo 1 per ogni passaggio. La principale differenza tra forma pura e forma in scala è che la forma in scala non richiede i passaggi 1.6, 1.7 e 1.8, che sono i passaggi di ridimensionamento.

1. Segmenta il bordo esterno di ogni organoide. Utilizza un approccio computazionale oppure lo fai manualmente tramite un software base di editing immagini, come Paint di Microsoft, Preview di MacOS o Fiji/ImageJ.
2. Estrarre i contorni degli organoidi come maschere aperte che sono linee blu su una tela bianca. Usa Fiji/ImageJ per estrarre le maschere o lo script Python^{fornito 16}.
3. Isola ogni contorno blu su una tela bianca a parte. Usa Fiji/ImageJ per estrarre le maschere o lo script Python^{fornito 16}.
4. Ritaglia ogni contorno in modo che abbia un margine di un pixel su tutti e quattro i lati dell'oggetto blu. Usa Fiji/ImageJ o lo script Python^{fornito 16}.
5. Aggiungi 100 pixel di spazio bianco su tutti e quattro i lati per creare nuovi margini. Usa Fiji/ImageJ o lo script Python^{fornito 16}.
6. Ruota ogni contorno in modo che la linea interna più lunga sia verticale. Usa Fiji/ImageJ o lo script Python^{fornito 16}.
7. Esegui la trasformata LCPC su ogni contorno. Usa script Python forniti per il metodo radiale^{grid 18} o il metodo parallel^{grid 19}.

Risultati

La trasformata radiale a griglia LCPC applicata agli organoidi del tumore al seno

Gli organoidi e i tumori 3D possono assumere una varietà di forme, alcune delle quali sono ovviamente diverse all'occhio umano, anche se le metriche tradizionali producono differenze statisticamente insignificanti. D'altra parte, gli organoidi possono anche mostrare forme che sembrano eterogenee, e quindi insignificanti, all'occhio umano, mascherando morfologie s...

Discussione

Come per qualsiasi strumento computazionale, la qualità dell'output dipende dal fatto che gli input rispettino o meno le regole attese attorno alle quali lo strumento è stato progettato. Le seguenti regole devono essere seguite e utilizzate come controlli di qualità quando si utilizzano gli script Python forniti. Per prima cosa, assicurati che le maschere aperte siano linee blu su sfondo bianco. Il blu è stata una decisione arbitraria e non ha importanza, ma gli script che esegueno la tr...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook