Protocollo per il tracciamento e la quantificazione comportamentale automatizzata in Drosophila melanogaster

Sommario

Questo protocollo utilizza la stima della pose da parte di Python per tracciare punti chiave del corpo nelle Drosophila accoppiate, facilitando la quantificazione automatica di comportamenti sociali sottili, specialmente nelle interazioni sociali, oltre a mappe termiche e traiettorie locomotorie.

Abstract

Per sviluppare uno strumento analitico open source che superi i limiti dei metodi tradizionali di tracciamento basati su centroidi, presentiamo un protocollo per analizzare accuratamente le interazioni sociali nelle coppie di Drosophila che si comportano liberamente. In particolare, questo protocollo si ispira al framework high-resolution network (HRNet) per monitorare simultaneamente cinque punti chiave anatomici — testa, torace, addome e punte delle ala sinistra e destra — con l'obiettivo di generare dati di coordinate ad alta risoluzione per un'analisi quantitativa successiva dei comportamenti sociali. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro completo basato su Python e un'interfaccia grafica utente (GUI) che abbiamo progettato, inclusa la costruzione di dataset, l'addestramento dei modelli e l'estrazione automatica delle coordinate, insieme a moduli integrati per generare heatmap di occupazione spaziale, traiettorie locomotorie e rapporti di interazione sociale nelle mosche. Per convalidare questo quadro, è stato testato utilizzando due ceppi ampiamente utilizzati, w1118 e Canton-S (CS). I nostri risultati hanno dimostrato la stabilità del rilevamento dei punti chiave e hanno rivelato differenze specifiche per genotipo nell'utilizzo spaziale e nella struttura della locomotiva. Questa metodologia fornisce una base scalabile per l'etologia quantitativa e l'analisi automatizzata delle interazioni sociali in Drosophila, riducendo allo stesso tempo lo sforzo di annotazione manuale e migliorando la riproducibilità.

Introduzione

Drosophila melanogaster è un organismo modello ampiamente utilizzato con potenti strumenti genetici e circuiti neurali ben mappati che permettono la dissezione meccanicistica del comportamento¹. Ha una vasta gamma di comportamenti sociali, tra cui corteggiamento e aggressività, e una forte capacità di apprendimento 2,3,4,5,6,7,8. Ognuno è composto da elementi motori distinti controllati da un sistema nervoso compatto ma estremamente ben organizzato. È importante sottolineare che una misurazione precisa della postura corporea è essenziale per comprendere le basi neurologiche della selezione delle azioni, poiché molti di questi comportamenti contengono motivi posturali a grana fine che codificano informazioni contestuali e dello stato^{interno 9,10}.

Nonostante la necessità di una risoluzione a singola mosca per catturare le differenze individuali, molti saghi comportamentali ad alto throughput in Drosophila si basano ancora su indici a livello^{di gruppo 11}. Saggi comportamentali ad alto rendimento includono test T-maze per la preferenza^{sociale 12,13}, saghi di spaziamento sociale che quantificano la distanza tra mosche, o paradigmi di aggregazione/evitamento sotto stimolazione^{sensoriale 14} che possono catturare efficacemente le tendenze della popolazione. Tuttavia, implicano intrinsecamente la media tra individui, oscurando così l'eterogeneità nelle sequenze d'azione e nella struttura temporale degli scambi sociali. Nel corso degli anni, i tentativi di avvicinarsi all'identificazione per mosca si sono basati su metodi funzionalmente vincolati, come il rilevamento degli eventi basato su regole tramite soglie cinematiche, la sottrazione di background con tracciamento del centroide e l'annotazione video^manuale 15,16,17,18. Di conseguenza, comportamenti discreti come l'affondamento, il tocco o le minacce alari vengono spesso ignorati o etichettati erroneamente, richiedendo una notevole correzione manuale. Tali vincoli hanno limitato gli studi meccanicistici che richiedono un allineamento temporale preciso tra l'attività neurale e le azioni individuali.

Una soluzione rivoluzionaria è ora disponibile grazie ai recenti sviluppi nella visione artificiale e nella stima della posa basata su machine learning. I framework open-source come DeepLabCut¹⁹ e SLEAP²⁰ consentono il rilevamento delle parti del corpo senza marcatori, la classificazione scalabile di azioni discrete e la preservazione dell'identità individuale anche durante interazioni ravvicinate. Queste caratteristiche superano gli svantaggi degli approcci precedenti basati su gruppi e guidati da regole e permettono una quantificazione ripetibile di comportamenti sociali complessi.

Le interazioni individuali in Drosophila sono caratterizzate da caratteristiche motorie uniche che indicano la progressione delle interazioni sociali. L'aggressività, ad esempio, include comportamenti tipici come l'affondamento, le minacce alle ali e il grappling, tutti elementi che rappresentano fasi di conflitto in crescita^21,22. Il corteggiamento è definito in modo simile dall'orientamento, dall'estensione unilaterale delle ali con la produzione del canto, il tapping e il tentativo di accoppiamento, che si uniscono per formare la sequenza temporale delle interazioni^{di accoppiamento 23}. Catturare questi motivi dipende dal riconoscimento accurato della postura corporea e dei movimenti^{articolari 24,25}. In pratica, il campionamento richiede un'elevata risoluzione spaziale e temporale su lunghi periodi di registrazione per garantire che schemi motori sottili possano essere rilevati e allineati con precisione all'attività^{neurale 25,26}.

Qui presentiamo un framework open-source basato sulla visione per l'identificazione automatica di cinque punti chiave anatomici—testa, torace, addome, punte dell'ala sinistra e^{destra 27}. Il sistema comprende un flusso di lavoro completo per la costruzione di dataset, l'addestramento del modello e l'estrazione delle coordinate, e produce dati di serie temporali ad alta risoluzione adatti per una classificazione comportamentale personalizzabile. Automatizzando i processi di annotazione manuale e standardizzando i flussi di lavoro analitici, il nostro metodo consente un'analisi quantitativa su scala fine dei comportamenti di interazione sociale, aumentando efficienza e riproducibilità riducendo significativamente il tempo e il lavoro necessari per l'analisi.

Per validare l'affidabilità del sistema, lo abbiamo applicato a due ceppi di laboratorio comunemente usati, w1118 e Canton-S (CS), e osservato una rilevazione stabile dei punti chiave tra i fotogrammi, oltre a differenze specifiche per genotipo nell'occupazione spaziale, nelle caratteristiche della traiettoria e negli indicatori di interazione sociale basati sulla distanza della testa e sull'angolo di orientamento. I ricercatori possono valutare l'idoneità di questo protocollo in base alla risoluzione spaziotemporale richiesta (≥30 fps, ≤0,5 mm/pixel) e alle condizioni di registrazione video (illuminazione e contrasto). La dimensione dei pixel può essere determinata direttamente dalle impostazioni della fotocamera. Una mosca della frutta con una lunghezza corporea misurata può essere posizionata all'interno del campo visivo per la calibrazione. Questo protocollo è particolarmente adatto per i seguenti scenari: necessità di tracciare simultaneamente due Drosophila che interagiscono liberamente e distinguere le loro identità individuali; concentrandosi su posture precise (ad esempio, angolo della testa e distanza) piuttosto che solo sulle posizioni del centroide; durata di registrazione superiore a 10 minuti quando l'annotazione manuale non è fattibile; richiedendo un allineamento temporale a livello di millisecondi tra eventi comportamentali e attività neurale (ad esempio, imaging del calcio o elettrofisiologia) nelle analisi successive.

Protocollo

1. Preparazione alla mosca

1. Raccogliere e sessare le mosche di circa 3–4 giorni sotto breve anestesia CO₂ prima degli esperimenti.
   NOTA: La durata dell'anestesia e la portata di CO₂ possono variare a seconda delle specifiche e della pressione del cilindro di anidride carbonica utilizzato in ogni laboratorio. Le mosche devono essere monitorate continuamente durante l'anestesia e l'esposizione alla CO₂ deve essere mantenuta solo fino a quando non sono completamente anestetizzate e non manifestano una completa cessazione del movimento.
2. Posizionare ogni mosca singolarmente in un tubo Falcon da 50 mL contenente un mezzo standard di farina di mais–agar–glucosio–lievito.
3. Mantieni le mosche a 25 °C durante un ciclo di 12 ore chiaro/scuro fino all'uso.

2. Costruzione dell'arena

1. Prepara due piastre acriliche trasparenti da 3 mm e una lastra di polietilene da 3 mm.
2. Incide quattro camere circolari (ciascuna con un diametro di 35 mm) al centro della lastra di polietilene.
3. Usa le clip per incollare una piastra acrilica alla piastra di polietilene per formare la base della camera; Tieni la seconda piastra in acrilico come copertura rimovibile.

Figura 1: Schema dell'arena comportamentale e dell'impostazione per l'imaging. (A) La costruzione di una camera di osservazione personalizzata è rappresentata nel diagramma. La camera è composta da tre strati principali: una piastra di base acrilica trasparente da 3 mm; una piastra in polietilene da 3 mm con quattro squaffe circolari da 35 mm di diametro che fungevano da singoli pozzi per la camera; e una seconda piastra acrilica che funge da copertura rimovibile. (B) Un morsetto adattatore a 90° viene utilizzato per installare la fotocamera verticalmente su un palo ottico da 40 cm. Per l'imaging dall'alto verso il basso, la telecamera è posizionata direttamente sopra l'arena di osservazione multilivello con il suo asse ottico perpendicolare alla superficie della camera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Configurazione per l'imaging

1. Assemblare due poli ottici da 20 cm e uno da 40 cm con morsetti adattatori a 90°.
2. Montare la fotocamera (1280 × 1024 pixel) verticalmente sul palo da 40 cm, allineata perpendicolarmente alla superficie dell'arena, e impostare il frame rate a 150 fps.
3. Posizionare l'arena su un pannello LED dimmerabile bianco diurno di 25 cm × 25 cm rivestito da un foglio di diffusione.
4. Regola l'illuminazione a circa 1500 lux sulla superficie dell'arena.
   NOTA: Assicurarsi che i bordi alari rimangano visibili nell'anteprima binaria. Evita >2000 lux per prevenire artefatti indotti dal calore, poiché le mosche possono cambiare la loro locomozione naturale o distribuzione a causa dello stress termico della fonte luminosa.

4. Procedura di registrazione

1. Metti da 3 cm di schiuma sotto ogni angolo dell'arena per stabilizzarlo.
2. Trasferire le coppie di mosche sotto anestesia CO₂ nelle camere; sigilla con la piastra acrilica superiore.
3. Lascia che le mosche si acclimatino per 40 minuti prima di registrare.
4. Inizia l'acquisizione video usando^{MIAS.exe 27}: premi q per iniziare e c per fermarti.
   NOTA: Questo porta a registrazioni video continue di coppie di mosche che interagiscono liberamente in condizioni standardizzate.

5. Definire il pannello di attività sociale

1. Esegui lo script di preprocessing: python SoAL_PreProcess.py [video_file_path]
   NOTA: Tutti gli script di codifica sono forniti nel File Supplementare 1.
2. Annotare l'area della camera e assegnare i metadati sotto forma di Genotype_age (giorni) × 1 (numero di camere). (ad esempio, CS_3 × 1)
3. Regolare il cursore della soglia di rilevamento finché le ali non diventano quasi invisibili nell'immagine binaria per garantire una sottrazione ottimale dello sfondo e una visibilità alare.

6. Preparazione del dataset

1. Crea una nuova cartella dataset eseguendo:
   Strumenti python/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME 10 (intervallo di campionamento dei frame)
   NOTA: Il parametro dell'intervallo di campionamento del frame ("10") è stato adattato da un^{protocollo 27} precedentemente pubblicato. Valori più bassi aumentano la densità di campionamento e il carico computazionale, mentre valori più alti riducono la domanda computazionale e possono essere adattati in base alle prestazioni hardware disponibili e ai requisiti sperimentali.
2. Imposta il percorso video e il percorso dataset in 'tools/SoAL_DatasetUtils.py'
3. Interfaccia di etichettatura manuale di avvio:
   >strumenti python/SoAL_LabelUI.py DATASETNAME
   1. Navigazione dei fotogrammi: Premi il tasto Spazio o il tasto Z per navigare rispettivamente al fotogramma successivo o al precedente. In alternativa, usa il cursore della timeline per la navigazione.
   2. Etichettatura dei punti chiave: Clicca sulla posizione corretta di una mosca in ogni immagine (in una sequenza specifica: testa, torace, addome, ala sinistra e ala destra) per segnare i 5 punti chiave.
   3. Selezione dei punti chiave: Premi i tasti numerici per selezionare un punto chiave (indicato da un cerchio bianco). Il clic successivo riassegnerà un nuovo numero al punto chiave selezionato.
   4. Salvataggio: Chiudi la finestra o premi il tasto D per salvare i risultati dell'annotazione.
      NOTA: Un archivio completo di set di addestramento comprende due componenti: una directory immagini e un file annotation.json.

7. Addestramento al modello

1. Dividi il dataset in set di addestramento e validazione:
   strumenti python/SoAL_DatasetGen.py DIVISIONE DEI NOMI DEL DATASET
   Verranno create due nuove cartelle in 'dataset/.'
2. Configurare i parametri di addestramento in hrnet/fly_w32.yaml:
   Fattore di rotazione: 15°
   Fattore di scala: 0,35
   Fattore di luminosità: 0,25
   Dimensione del lotto: 24
   Epoche: 200
3. Esegui il programma di formazione:
   python hrnet/tools/train.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Terminare i set di addestramento quando la precisione media (AP) si stabilizza; mantenere il miglior modello (AP > 90%).
4. Valida il modello utilizzando:
   python hrnet/tools/test.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Risultato: Modello robusto basato su HRNet per il rilevamento dei key-point multi-fly.

8. Esegui il programma di rilevamento

1. Copia nuovi file video nella directory video.
2. Annota i metadati come mostrato nel passo 5.
3. Esegui il programma di rilevamento: python SoAL_KptDetect.py tutti
4. Ispezionare i risultati della rilevazione:
   Strumenti/SoAL_ViewKptUI.py excel_file_path Python (.cvs/xslx)
   Risultato: coordinate bidimensionali di cinque punti di riferimento anatomici per mosca attraverso i fotogrammi.

9. Quantificazione comportamentale

1. Avvia un'applicazione GUI autonoma per l'analisi (Supplementary File 2) e importa file di coordinate nell'interfaccia.
2. Genera heatmap di occupazione spaziale (densità di probabilità delle posizioni dell'arena).
3. Ricostruisci le traiettorie locomotorie a partire da serie temporali di coordinate.
4. Crea dati sulle interazioni sociali, inclusi distanza della testa, orientamento e stato sociale derivato.
   Esame: visualizzazione standardizzata dell'uso spaziale specifico del genotipo e della dinamica del movimento.

Risultati

La Figura 1 illustra la geometria dell'arena, la configurazione dell'illuminazione e la posizione della telecamera utilizzate per registrare le interazioni sociali naturali in Drosophila. L'installazione garantisce un'illuminazione uniforme e condizioni di imaging stabili adatte alla stima della posa e all'estrazione delle coordinate.

La stima automatica della posa è stata applicata a tutti i video registrati per estrarre...

Discussione

Il nostro studio dimostra che la stima della posa basata sul machine learning fornisce un metodo scalabile e affidabile per misurare interazioni sociali a grana fine nella Drosophila. Supera i limiti degli approcci basati sul^centroide 15,16,17,18 tracciando cinque punti chiave anatomici in coppie che interagiscono liberamente, permettendo l'acquisizione di informazioni angolari fornite dall'asse del corpo e dalla distanza testa-testa dedotta dai punti tes...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar	BioFroxx	8211GR500
camera(MV-CU013-A0UC)	Hikvision	MV-CU013-A0UC
Carbon Dioxide	Messer	124-38-9
D(+)-Glucose anhydrous	BioFroxx	1179GR500
Drosophila Narrow Vials (Falcon tube)	Biolgix	51-0500
Ethanol	Chron Chemicals	64-17-5
LED panel	/	/	su misura
Methylparaben	Sigma	99-76-3
polyethylene plate	/	/	su misura
Python	/	versione 3.6
Sucrose	DaMao	57-50-1
transparent acrylic plates	/	/	su misura
Yeast	Angel	100004237033