Isolamento del microbiota associato ai semi di pomodoro tramite germinazione controllata e coltura comparativa

Sommario

Questo protocollo combina la sterilizzazione standardizzata della superficie dei semi con la germinazione controllata per consentire l'isolamento riproducibile del microbiota associato ai semi di pomodoro durante la transizione dal seme alla piantinella. L'approccio favorisce il recupero dei microrganismi coltivabili sottorappresentati nei semi secchi e supporta studi culturali comparativi durante lo sviluppo precoce delle piantine.

Abstract

La sterilizzazione superficiale è un passo critico ma spesso poco ottimizzato negli studi volti a isolare microrganismi associati ai semi, poiché trattamenti eccessivamente aggressivi possono ridurre o distorcere le popolazioni microbiche endogene. Questo protocollo presenta un approccio riproducibile per isolare il microbiota associato ai semi di pomodoro coltivabili utilizzando condizioni di sterilizzazione superficiale basate su metodologie precedentemente validate, combinate con la germinazione controllata dei semi. Invece di definire trattamenti di sterilizzazione universalmente ottimali, l'approccio applica condizioni standardizzate che possono essere regolate in base alle caratteristiche dei semi, minimizzando i bias e preservando le popolazioni microbiche endogene.

Per favorire il recupero dei microrganismi coltivabili associati alla transizione dal seme alla piantinella, il protocollo prevede una fase controllata di germinazione prima dell'isolamento microbico. A differenza degli approcci convenzionali basati sulla macerazione di semi secchi e non germinati, la germinazione controllata favorisce l'attivazione microbica durante la transizione dal seme alla piantina in condizioni sterili. Analisi comparative basate su unità formative di colonie (CFU) di repliche biologiche equivalenti, ciascuna costituita da materiale aggregato da 3–5 semi secchi o da 3–5 piantine germinate, hanno rivelato un marcato cambiamento nella comunità coltivabile dopo la germinazione. I generi debolmente rappresentati nei semi secchi si arricchivano dopo la germinazione, mentre altri taxa più abbondanti nei semi secchi diminuivano la loro rappresentazione relativa, supportando studi sulle prime interazioni pianta-microrganismo durante l'insediamento delle piantine.

Tra le repliche biologiche, generi come Stutzerimonas, Stenotrophomonas e Priestia sono stati costantemente arricchiti tra isolati recuperati da piantine germinate, mentre Paenibacillus è rimasto abbondante in tutte le condizioni ma ha mostrato cambiamenti marcati nella composizione a livello di specie. Integrando condizioni di sterilizzazione standardizzate con la germinazione controllata e l'analisi comparativa di materiale secco e germinato, questo protocollo fornisce un quadro solido e riproducibile per l'isolamento culturomico del microbiota associato ai semi con potenziale rilevanza funzionale durante lo sviluppo precoce delle piantine e supporta studi sulle prime interazioni pianta-microrganismo durante l'insediamento delle piantine.

Introduzione

I semi ospitano diverse comunità microbiche composte da batteri e funghi associati sia ai tessuti interni che alle superfici ^{esterne 1,2,3}. Questi microrganismi sono sempre più riconosciuti come componenti integranti della biologia vegetale perché possono influenzare le prestazioni delle piante fin dalle prime fasi dello sviluppo, inclusa la germinazione, l'insediamento delle piantine e le risposte allo stress biotico ^{e abiotico 1,2,3}. In termini ecologici, i semi funzionano non solo come propagoli per la riproduzione delle piante, ma anche come serbatoi di inoculo microbico, rendendoli un punto di ingresso fondamentale per comprendere come i microbiomi associati alle piante vengano avviati e mantenuti durante tutto il ciclo vitale ^{delle piante 1,2,3}.

I microrganismi associati ai semi possono costituire il primo inoculo microbico incontrato dalla pianta emergente e quindi contribuire all'assemblaggio del microbioma durante la transizione dal seme alla^{piantina 1,3,4}. Questo primo inoculo può influenzare le comunità microbiche che successivamente colonizzano radici e altri compartimenti vegetali, con conseguenze per l'insediamento delle piante e le successive interazioni^{pianta-microrganismo 1,4}. Inoltre, una parte del microbiota dei semi può essere trasmessa verticalmente attraverso strutture riproduttive come fiori, ovuli e polline, permettendo alle popolazioni microbiche di persistere attraverso le generazioni^{4 e 5.} Questa continuità intergenerazionale suggerisce che alcuni microrganismi trasmessi dai semi possano contribuire costantemente alla fitness e all'adattamento delle piante.

Dal punto di vista funzionale, i microrganismi associati ai semi possono influenzare le prestazioni dell'ospite attraverso diversi meccanismi, tra cui la produzione di fitormoni, composti antimicrobici e altri metaboliti bioattivi che modulano lo sviluppo delle piante o sopprimono concorrenti e ^{patogeni 5,6,7}. Le popolazioni microbiche trasmesse dai semi sembrano anche coesistere attraverso un uso differenziale delle risorse e la suddivisione ecologica, suggerendo che il seme rappresenti un habitat selettivo piuttosto che un contenitore passivo di diversità^{microbica 7}. Collettivamente, questi risultati supportano l'idea che i semi ospitino popolazioni microbiche che possono influenzare lo sviluppo precoce delle piante e rappresentano candidati per la caratterizzazione funzionale^{a valle} 2,3,5,7.

Per indagare i microrganismi associati ai semi in modo funzionalmente informativo e sperimentalmente trattabile, è necessario recuperare popolazioni microbiche vitali dal materiale seme. In questo contesto, l'isolamento microbico fornisce accesso a microrganismi viventi che possono successivamente essere caratterizzati sperimentalmente e valutati in saggi a valle rilevanti per le interazioni pianta-microrganismo. Questo è particolarmente importante nei sistemi di semi, dove i microrganismi associati al seme possono contribuire all'insediamento precoce della pianta e rappresentare candidati per lo screening funzionale e per l'uso applicato in futuro.

Il recupero dei microrganismi associati ai semi è altamente sensibile alle procedure di preparazione del campione, in particolare alla sterilizzazione superficiale, all'elaborazione dei tessuti e alla fase di sviluppo del materiale campionato. Questa sensibilità è particolarmente rilevante nei sistemi di semi perché la biomassa microbica è spesso bassa e piccole differenze procedurali possono influenzare fortemente sia il numero di unità che formano la colonia sia la composizione degli isolati. Tra queste variabili, la sterilizzazione superficiale è una delle più critiche e difficili da ottimizzare. La sterilizzazione è necessaria per ridurre la contaminazione epifita prima dell'isolamento microbico, tuttavia un'esposizione eccessiva agli sterilanti può ridurre la vitalità o la coltivazione dei microrganismi endogeni, mentre una sterilizzazione insufficiente può permettere ai taxa associati alla superficie di dominare le colture^{successive 8,9,10}. Di conseguenza, l'obiettivo della sterilizzazione non è massimizzare l'esposizione chimica, ma applicare il trattamento più mite che sopprima efficacemente la contaminazione superficiale preservando al contempo microrganismi interni^{recuperabili 5,11}.

Poiché l'efficienza della sterilizzazione dipende dalla specie vegetale, dalla struttura tissutale, dalle proprietà del rivestimento dei semi e dalla comunità microbica associata, i protocolli dovrebbero essere selezionati da metodologie precedentemente validate e poi adattati con cautela al sistema oggetto^{di studio 8,12,13}. Nei materiali a bassa biomassa come i semi di pomodoro, questo equilibrio è particolarmente importante: l'eccessiva sterilizzazione può ridurre drasticamente il recupero microbico, mentre la sottosterilizzazione aumenta la probabilità che contaminanti superficiali a rapida crescita dominino gli isolati ottenuti. Per questo motivo, l'efficienza della sterilizzazione dovrebbe essere verificata di routine piuttosto che presunta. La placcatura dell'acqua di risciacquo finale fornisce un controllo pratico per la contaminazione esterna residua, ma questo controllo deve sempre essere interpretato insieme al recupero microbico da omogeneati di semi o piantine. Un protocollo che fornisce controlli di risciacquo sterili ma pochi o nessun microbiota interno recuperabile può essere inadeguato quando l'obiettivo è l'isolamento microbico comparativo piuttosto che la massima^{decontaminazione} 6,8,10,14.

I confronti significativi, quindi, richiedono una forte standardizzazione procedurale. Nei campioni a bassa biomassa, incongruenze nel lavaggio, trasferimento, omogeneizzazione, diluizione, placcatura o incubazione possono alterare sia il recupero microbico totale sia la rappresentazione apparente dei singoli taxa. Questo è particolarmente importante quando si confronta materiale secco e germinato, dove la variazione metodologica può facilmente essere scambiata per un cambiamento biologico.

Un importante limite di molti protocolli di microbiologia dei semi è che si basano esclusivamente su semi secchi e non germinati come materiale di partenza. Sebbene questo fornisca un utile punto di riferimento per la frazione microbica presente prima dell'attivazione dei semi, può sottovalutare i microrganismi dormienti, metabolicamente inattivi, stressati o inizialmente presenti a bassa abbondanza relativa ^2,15.

Nello stato secco, i semi rappresentano un ambiente fisiologicamente quiescente in cui sia i tessuti ospiti che i microrganismi associati possono rimanere relativamente inattivi. Di conseguenza, le popolazioni microbiche recuperate direttamente dai semi secchi potrebbero non rappresentare completamente quelle che diventano più facilmente recuperabili una volta iniziata la germinazione.

Durante la germinazione, i semi subiscono assorbimento d'acqua, riattivazione metabolica, mobilizzazione dei nutrienti e riorganizzazione dei tessuti, tutti elementi che modificano l'ambiente locale disponibile ai microrganismi^{associati 11,16}. Questi cambiamenti possono favorire la crescita microbica, alterare la rappresentazione relativa delle popolazioni microbiche e facilitare la rilevazione o il recupero di taxa precedentemente rari o scarsamente recuperati nei semi secchi. Inoltre, l'emergere delle radici crea un nuovo compartimento vegetale che può supportare la proliferazione e la redistribuzione microbica, rendendo la transizione dal seme alla piantina una fase particolarmente informativa per l'analisi^{microbiologica 1,17}.

Per questo motivo, il trattamento parallelo di semi secchi e piantine germinate fornisce un disegno sperimentale più informativo rispetto all'analisi dei soli semi secchi. I semi secchi stabiliscono una base per le popolazioni coltivabili presenti prima dell'attivazione, mentre il materiale germinato consente una valutazione comparativa dei taxa che diventano più facilmente recuperabili durante lo sviluppo iniziale. Questo approccio è particolarmente utile quando l'obiettivo non è solo catalogare i microrganismi recuperabili, ma anche identificare i taxa associati alla transizione dal seme alla piantina e dare priorità agli isolati per la caratterizzazione a valle (Figura 1).

Figura 1: Panoramica concettuale e procedurale del flusso di lavoro di isolamento comparativo. (A) Rappresentazione concettuale della condizione del seme secco del pomodoro prima della germinazione. (B) Rappresentazione concettuale della condizione del seme di pomodoro germinato durante la transizione dal seme alla piantuna. (C) Flusso di lavoro schematico del protocollo, inclusa sterilizzazione della superficie dei semi, valutazione del risciacquaggio-controllo, trattamento diretto di semi secchi o germinazione controllata, omogeneizzazione di repliche biologiche aggregate, diluizione e placcatura seriali, quantificazione basata su CFU, recupero degli isolati, identificazione tassonomica e analisi comparativa di materiale secco e germinato. I punti di controllo critici evidenziati nel flusso di lavoro includono l'efficienza della sterilizzazione, repliche biologiche equivalenti e analisi coerenti di placcatura e CFU. I pannelli A e B sono stati preparati come illustrazioni concettuali assistite dall'IA solo per rappresentazione visiva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Poiché il protocollo è pensato per confrontare il recupero microbico da materiale secco e germinato, è essenziale una rigorosa coerenza metodologica. Tutti i confronti devono essere effettuati utilizzando lo stesso lotto di semi, condizioni di sterilizzazione identiche, lo stesso mezzo di coltura e procedure equivalenti di diluizione, impiccatura e incubazione. Senza questo livello di standardizzazione, le differenze apparenti tra campioni secchi e germogliati potrebbero riflettere variazioni tecniche piuttosto che un arricchimento biologicamente significativo. Questo è particolarmente importante nei flussi di lavoro di isolamento, dove la frazione recuperata è plasmata sia dal campione biologico sia dagli effetti selettivi della procedura sperimentale^{stessa 4,15}.

Anche la replicazione biologica è indispensabile. I taxa a bassa abbondanza possono variare tra i lotti di semi, e il recupero microbico da campioni a bassa biomassa è intrinsecamente stocastico anche in condizioni attentamente controllate. Sono raccomandate almeno cinque repliche biologiche indipendenti per ogni condizione per un confronto robusto. In questo flusso di lavoro, ogni replica biologica consiste in materiale aggregato da 3–5 semi secchi o da 3–5 piantine germinate processate come un singolo campione. Inoltre, tutte le manipolazioni dopo la sterilizzazione devono essere eseguite in condizioni asettiche per minimizzare la contaminazione secondaria e preservare l'interpretabilità del set di isolati risultante.

La durata della germinazione deve anche essere scelta con attenzione. Deve essere abbastanza lungo da permettere l'emergere delle radici e lo sviluppo precoce delle piantine, ma non così prolungato da introdurre una crescita ambientale aggiuntiva non legata alla transizione immediata dal seme alla piantinella. Per il pomodoro, un periodo di germinazione fino a 5 giorni in condizioni sterili offre una finestra pratica in cui la piantina rimane strettamente legata all'ambiente del seme mentre l'attivazione e la redistribuzione microbica precoce possono già verificarsi. Una tempistica coerente tra gli esperimenti è essenziale perché le differenze nello stadio di sviluppo possono esse stesse influenzare i modelli di recupero microbico. Questo flusso di lavoro è più adatto per il recupero comparativo del microbiota coltivabile da sistemi di semi a bassa biomassa quando l'obiettivo è valutare gli spostamenti associati alla germinazione in condizioni standardizzate. È meno adatto per la stima diretta della diversità totale del microbioma dei semi o per sistemi sperimentali in cui sono necessari approcci indipendenti dalla coltura per catturare la più ampia comunità microbica.

L'obiettivo di questo protocollo è fornire un quadro riproducibile per l'isolamento del microbiota associato ai semi di pomodoro coltivabili, integrando la sterilizzazione standardizzata delle superfici con la germinazione controllata dei semi. Il metodo consente un'analisi comparativa di semi secchi e piantine germinate utilizzando repliche biologiche equivalenti, ciascuna costituita da materiale aggregato da 3–5 semi secchi o da 3–5 piantine germinate, per valutare gli spostamenti dipendenti dalla germinazione nel recupero delle unità formative di colonie (CFU) e nella composizione tassonomica. Minimizzando il bias di sterilizzazione e promuovendo il recupero microbico durante la transizione dal seme alla piantina, questo approccio facilita l'isolamento di microrganismi con potenziale rilevanza funzionale durante lo sviluppo precoce della piantina e supporta studi a valle delle prime interazioni pianta-microrganismo.

Protocollo

1. Preparazione di reagenti, mezzi e materiali sterili

1. Prepara una soluzione di etanolo al 70% (v:v) utilizzando acqua distillata sterile.
2. Prepara una soluzione di lavoro al 20% (v:v) con candeggina commerciale contenente il 5% di ipoclorito di sodio disponibile, diluendo 20 mL di candeggina in 80 mL di acqua distillata sterile.
3. Prepara acqua distillata sterile per i passaggi di lavaggio.
4. Prepara NaCl sterile allo 0,45% per omogeneizzazione e diluizione seriale, e usa questa soluzione in modo coerente durante tutto il flusso di lavoro.
5. Prepara il mezzo di coltura agar Luria Bertani (LB) (per litro: 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito, 10 g di NaCl e 15 g di agar) e versa i piatti in anticipo in condizioni sterili.
6. Sterilizza tutti gli strumenti che entreranno in contatto con semi o piantine dopo la sterilizzazione, inclusi pinze, pestelli, spargiatori, forbici e portatuglie, tramite autoclaving o trattamento asettico validato.
7. Disponi piastre di Petri sterili, tubi, punte di pipetta e piastre di coltura all'interno di una cappa a flusso laminare prima di iniziare la gestione dei semi.
   NOTA: Poiché la biomassa microbica associata ai semi può essere bassa, è importante ridurre al minimo i tempi di manipolazione inutili e avere tutti i materiali pronti prima di iniziare la sterilizzazione. I ritardi tra trattamenti chimici, lavaggi, placcatura o configurazione della germinazione possono introdurre variabilità nel recupero. Buffer sterili alternativi possono essere utilizzati in altri sistemi sperimentali, ma un singolo buffer dovrebbe essere mantenuto durante ogni esperimento comparativo. Supporti aggiuntivi come il 2A di Reasoner (R2A) o mezzi selettivi possono essere inclusi in flussi di lavoro culturomici estesi, ma l'agar LB è stato utilizzato come mezzo standard per il protocollo comparativo descritto qui.

2. Selezione e assegnazione dei semi

1. Usa semi da un singolo lotto di semi di pomodoro per ogni esperimento quando possibile.
   NOTA: Nel flusso di lavoro rappresentativo descritto qui, semi di pomodoro provenienti da un singolo lotto di CV. Money Maker sono stati utilizzati in ogni esperimento.
2. Ispeziona visivamente i semi e scarta i semi danneggiati, visibilmente rotti o malformati.
3. Dividere i semi nei gruppi sperimentali necessari per lo studio. Al minimo, assegna i semi a: isolamento a secco dopo la sterilizzazione e germinazione seguita dall'isolamento delle piantine.
4. Se si devono testare più condizioni di sterilizzazione, assegnare i semi casualmente tra i trattamenti di sterilizzazione per evitare pregiudizi causati dalla dimensione o condizione dei semi.
   NOTA: Tutti i confronti a valle sono più forti quando basati sullo stesso lotto di semi processato in parallelo. Il flusso di lavoro può essere adattato ad altri genotipi o varietà di pomodoro, ma qualsiasi confronto all'interno di un esperimento dovrebbe essere effettuato utilizzando un singolo lotto di semi processato in parallelo.

3. Sterilizzazione superficiale dei semi di pomodoro

1. Trasferire 3–5 semi in ogni tubo microcentrifuga sterile da 2 mL all'interno di una cappa a flusso laminare.
2. Aggiungi 1 mL di etanolo al 70% (v:v) in ogni tubo per immergere completamente i semi.
3. Incuba i tubi per 5 minuti con un delicato mescolamento con il rotatore a 25 giri/min.
4. Rimuovi completamente l'etanolo usando una pipetta sterile.
5. Aggiungi immediatamente 1 mL della soluzione lavorativa ipoclorito di sodio al 20% (v:v) a ogni tubo per immergere completamente i semi.
6. Incubare i tubi per 10 minuti con una leggera agitazione del rotatore a 25 giri al minuto.
7. Rimuovi completamente la soluzione di ipoclorito di sodio usando una pipetta sterile.
8. Lava i semi tre volte con 1 mL di acqua distillata sterile per ogni lavaggio.
   1. Per ogni lavaggio, aggiungi acqua sterile, mescola delicatamente per 30 secondi, lascia che i semi si depositino per 30 secondi se necessario, e rimuovi completamente la soluzione prima di aggiungere acqua fresca sterile.
9. Trattieni l'acqua finale di risciacquo da ogni tubo per controllare l'efficienza della sterilizzazione.
10. Trasferire i semi sterilizzati in piastre di Petri sterili o tubi sterili, a seconda che vengano processati immediatamente come semi secchi o utilizzati per una germinazione controllata.
    ATTENZIONE: Maneggiare l'ipoclorito di sodio utilizzando le attrezzature di protezione personale appropriate e eseguire tutte le procedure di sicurezza chimica istituzionale.
    NOTA: La sequenza etanolo-ipoclorito di sodio utilizzata qui è stata selezionata come condizione di lavoro standardizzata per i semi di pomodoro basandosi su flussi di lavoro di sterilizzazione precedentemente validati. Utilizzare le stesse condizioni di sterilizzazione per tutti i campioni inclusi in un esperimento comparativo. Se vengono valutati più di un regime di sterilizzazione, si elabora ogni trattamento in parallelo e si valuta indipendentemente l'efficienza della sterilizzazione per ogni condizione. Minimizzare il tempo tra il lavaggio finale e il trattamento a valle per ridurre la variabilità nel recupero microbico.

4. Verifica dell'efficienza della sterilizzazione

1. Prepara diluizioni seriali di 10 volte dell'acqua finale di risciacquo in NaCl sterile allo 0,45% trasferendo 100 μL di acqua di risciacquo in 900 μL di diluente e ripetendo lo stesso passaggio in sequenza fino a ^10-4. Placcare 100 μL di ogni diluizione su agar LB utilizzando lo stesso metodo di placcatura applicato agli omogeneati di semi secchi e piantini germinati.
2. Incubare le placche a 28 °C per 24–48 ore.
3. Ispezionare le placche per la crescita della colonia dopo l'incubazione.
4. Registra la presenza o l'assenza di colonie per ogni diluizione. Se sono presenti colonie, registra il livello di diluizione, il numero approssimativo di colonie e la morfologia visibile della colonia.
   NOTA: Utilizzare lo stesso volume di placcatura e formato di placcatura durante tutto l'esperimento per consentire un confronto diretto tra i controlli di risciacquo e i campioni biologici. Se non vengono rilevate colonie nelle piastre di controllo del risciacquo non diluite o a diluizione più bassa, registrare il campione come assenza di crescita rilevabile nelle condizioni di coltura utilizzate.

5. Lavorazione di semi secchi (non germinati)

1. Trasferire set aggregati di 3–5 semi secchi sterilizzati, corrispondenti a una replica biologica, in tubi microcentrifuga sterili da 2 mL contenenti 1 mL di NaCl sterile allo 0,45%.
2. Omogeneizzare i semi usando un pestello sterile e usa e getta finché i tessuti dei semi non sono visibilmente disturbati e non restano strutture intatte.
3. Vortice omogenea per 30 secondi per sospendere uniformemente le cellule microbiche.
4. Preparare diluizioni seriali 10 volte dell'omogenato in NaCl sterile allo 0,45% trasferindo 100 μL di omogeneato in 900 μL di diluente per la prima diluizione e ripetendo lo stesso rapporto sequenzialmente fino a ^10-6.
5. Placca 100 μL delle diluizioni selezionate su agar LB utilizzando placcatura spread.
6. Incubare le placche a 28 °C per 24–72 ore.
7. Seleziona le lastre corrispondenti all'intervallo di diluizione che producono colonie isolate e numerabili per la stima a valle della CFU e il recupero isolato.
8. Registra il numero totale di colonie, i morfotipi visibili delle colonie e eventuali differenze nel modello di crescita tra le repliche.
   NOTA: Eseguire la lavorazione dei semi secchi in parallelo con campioni di piantine germinate utilizzando lo stesso mezzo di coltura, schema di diluizione, volume di impiccatura e condizioni di incubazione. L'agar LB è stato utilizzato come mezzo standard per il flusso di lavoro comparativo descritto qui. Ulteriori mezzi possono essere incorporati nei flussi di lavoro di isolamento estesi quando è necessario un recupero più ampio di taxa a crescita lenta.

6. Germinazione axenica di semi sterilizzati

1. Posizionare i semi sterilizzati su supporti sterili per la germinazione, come piastre agar Murashige e Skoog (MS).
2. Distribuire i semi in modo uniforme per evitare il contatto tra le piantine emergenti.
3. Sigillare le piastre con pellicola di sigillazione da laboratorio o materiale equivalente che riduca la contaminazione esterna permettendo una germinazione normale.
4. Incubare le piastre orizzontalmente a 25 °C al buio.
5. Lasciare che i semi germinino in condizioni sterili fino a quando l'inizio precoce della radice non è chiaramente visibile; nell'esperimento rappresentativo, ciò corrispondeva a 5 giorni di incubazione.
6. Ispeziona regolarmente le piastre per segni di contaminazione, germinazione anomala o eccessiva condensa.
   NOTA: Le condizioni di germinazione devono essere mantenute costanti tra le repliche. La variazione nella durata della germinazione o nello stadio della piantina può alterare il recupero microbico indipendentemente dall'effetto studiato. Altri supporti sterili per la germinazione, inclusi piastre Phytoagar o carta filtrante umida sterile, possono essere utilizzati in flussi di lavoro adattati, a condizione che il supporto rimanga costante all'interno di ogni esperimento. Per l'incubazione possono essere utilizzate orientazioni alternative delle piastre, a seconda del contenitore di germinazione, ma l'orientamento deve essere mantenuto costante all'interno dell'esperimento. (Punto di pausa) Le piantine germinate possono essere tenute brevemente a 4 °C prima della lavorazione se necessario, ma si preferisce la lavorazione immediata quando possibile.

7. Isolamento di microrganismi da piantine germinate

1. Raccogli le piantine germinate usando pinze sterili all'interno di un cappuccio a flusso laminare.
2. Trasferire il materiale aggregato da 3–5 piantine germinate, corrispondenti a una replica biologica, in tubi microcentrifughe sterili da 2 mL.
3. Aggiungi 1 mL di NaCl sterile allo 0,45% a ogni provetta.
4. Omogeneizzare accuratamente il materiale della piantina raccolta utilizzando un pestello sterile e usa e getta, assicurandosi che sia la radice emergente sia il tessuto residuo associato siano inclusi, finché i tessuti non saranno visibilmente disturbati.
5. Vortice omogena per 30 secondi per liberare e risospendere uniformmente le cellule microbiche.
6. Preparare diluizioni seriali di 10 volte dell'omogeneato in NaCl sterile allo 0,45% trasferendo 100 μL di omogeneato in 900 μL di diluente per la prima diluizione e ripetendo lo stesso rapporto sequenzialmente fino a ^10-4.
7. Placca 100 μL delle diluizioni selezionate su agar LB utilizzando il settore e la placcatura a drop.
8. Incubare le placche a 28 °C per 24–72 ore. Registra il numero totale delle colonie, i morfotipi visibili delle colonie e le differenze rispetto ai campioni di semi secchi.
   NOTA: Definire una replica biologica come materiale aggregato da 3–5 piantine germinate e processare tutte le repliche in parallelo utilizzando lo stesso schema di diluizione, volume di placcatura, mezzo di coltura e condizioni di incubazione. Includere sia il tessuto residuo del seme sia la radice emergente nell'omogeneato per mantenere la coerenza tra i campioni di piantine germinate.

8. Conteggio delle colonie e recupero isolati

1. Dopo l'incubazione, si selezionano le lastre di diluizione che producono colonie numerabili e ben separate. Usa piastre contenenti 30–300 colonie per la stima della CFU.
2. Contare le colonie sulle placche selezionate e calcolare la CFU per replica biologica utilizzando la seguente formula:
   CFU per replica = (numero di colonie × fattore di diluizione)/volume placcato (millilitri)
   1. Se si usano più di una lastra della stessa diluizione, si calcola il numero medio di colonie per quella diluizione prima di applicare la formula.
3. Registra la morfologia della colonia usando descrittori standardizzati, inclusi dimensione, forma, colore, bordo, elevazione e opacità.
4. Seleziona le colonie per l'isolamento a valle per minimizzare il bias di campionamento. Seleziona tutti i morfotipi distinguibili quando il numero di colonie è basso, oppure seleziona casualmente più colonie su placche quando il numero di colonie è alto.
5. Rimettere in repole le colonie selezionate su lastre di agar LB freschi per ottenere colture pure.
6. Ripetere il ripristino finché ogni isolato non mostra una morfologia uniforme della colonia sulla placca.
   NOTA: Riportare chiaramente se i valori CFU sono espressi per replica biologica, per unità di biomassa o utilizzando un altro approccio di normalizzazione. Se vengono applicati approcci di normalizzazione aggiuntivi, inclusa la normalizzazione basata sulla biomassa, descrivi esplicitamente il metodo di calcolo nella sezione analisi dei dati.

9. Conservazione degli isolati purificati

1. Inoculare le colonie pure in un mezzo di coltura liquido LB e incubare fino a ottenere una crescita visibile.
2. Mescolare la coltura (1:1, v:v) con glicerolo sterile all'80% secondo la prassi microbiologica standard.
3. Conserva le criostoccare a -80 °C.
4. Mantenere un registro digitale per ogni isolato, inclusi origine del campione, numero di replica, condizione (seme secco o piantina germinata), trattamento di sterilizzazione, data di isolamento, mezzo a lastre, morfologia della colonia e stato di identificazione a valle.
   NOTA: Metadati dell'isolato accurati sono essenziali se si vogliono collegare i modelli di arricchimento allo stadio del seme, al trattamento o alla replica biologica.

10. Identificazione molecolare degli isolati

1. Estrarre il DNA genomico da colture batteriche purificate utilizzando un kit di estrazione del DNA batterico secondo le istruzioni del produttore.
2. Amplificare il gene batterico 16S rRNA utilizzando la regione ipervariabile V5-V8 o il gene rRNA 16S quasi a lunghezza completa.
   1. Per l'amplificazione della regione V5–V8 (~700 bp), usare gli innesco 799F (5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′) e 1392R (5′- ACGGGCGGTGTGTRC-3′).
   2. Per l'amplificazione del gene rRNA 16S quasi a lunghezza completa (~1500 bp), si usano i primer 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) e 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′).
   3. Preparare ogni reazione a catena della polimerasi (PCR) in un volume finale di 25 μL utilizzando una miscela master PCR, 0,4 μM di ciascun primer e 1 μL di DNA modello.
   4. Utilizzare un termociclatore nelle seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 95 °C per 2 minuti; 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 3 secondi, ricottura a 45 °C per 30 secondi ed estensione a 72 °C per 2 minuti; seguita da un'estensione finale a 72 °C per 7 minuti. Includere un controllo senza template in ogni esecuzione PCR.
3. Verifica i prodotti PCR tramite elettroforesi su un gel di agarosio all'1% e visualizza gli amplicon utilizzando un sistema di elettroforesi e imaging in gel.
4. Purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di pulizia PCR secondo le istruzioni del produttore e inviare gli amplicon purificati per il sequenziamento Sanger.
5. Controlla la qualità, rifinitura e assembla le sequenze risultanti dove necessario.
   1. Confronta ogni sequenza con il database dei nucleotidi del National Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizzando BLASTn (impostazioni megablast per sequenze altamente simili).
   2. Usa il colpo meglio supportato per assegnare la tassonomia. Assegnare gli isolati al livello di genere quando il miglior risultato mostra una copertura adeguata dell'allineamento e almeno il 94,5% di identità di sequenza.
   3. Utilizzare un'assegnazione provvisoria a livello di specie solo quando il miglior risultato mostra almeno il 98,7% di identità di sequenza, alta copertura delle query e nessuna corrispondenza tra le prime corrispondenti tra specie strettamente correlate.
   4. Se l'amplificazione ripetuta fallisce o la qualità della sequenza è insufficiente, registra l'isolato come Non identificato. Poiché la sola somiglianza del rRNA 16S potrebbe non risolvere specie batteriche strettamente correlate, considera tutte le assegnazioni a livello di specie come provvisorie e confermale tramite analisi filogenetiche o basate sul genoma quando necessario.
6. Segnalare l'identità dell'isolamento alla massima risoluzione tassonomica supportata. Utilizzare queste identificazioni per convalidare il raggruppamento basato sulla morfologia e per dare priorità agli isolati rappresentativi per analisi genomiche e funzionali a valle.
   NOTA: Questo passaggio di identificazione molecolare è destinato a supportare la classificazione isolata e la selezione rappresentativa dei ceppi. Non dovrebbe essere usato per dedurre la struttura della comunità o i modelli quantitativi di abbondanza tra i trattamenti.

11. Analisi dei dati

1. Esegui l'esperimento con almeno cinque repliche biologiche per condizione.
   NOTA: In questo flusso di lavoro, ogni replica biologica consiste in materiale aggregato da 3–5 semi secchi o da 3–5 piantine germinate processate come un singolo campione.
2. Per ogni condizione, quantificare: (i) il recupero totale della CFU, (ii) il numero di morfotipi visibili delle colonie, (iii) il numero di isolati purificati e (iv) la composizione tassonomica del microbiota coltivabile recuperato a livello di genere e, dove rilevante, a livello di specie.
3. Confrontare campioni di semi secchi e di piantine germinate per valutare i cambiamenti dipendenti dalla germinazione nel recupero totale e nella composizione tassonomica.
4. Calcola la rappresentazione relativa di ogni taxon come percentuale del totale delle CFU recuperate in ciascuna condizione. Calcola le variazioni di fold usando valori assoluti di CFU.
5. Analizzare dati quantitativi utilizzando un software di analisi statistica appropriato (ad esempio, GraphPad Prism [v11.0.2]). Riporta i dati come media ± deviazione standard (SD).
   1. Per confronti a coppie tra campioni di semi secchi e piantini germinati, si utilizza un test t di Student a due code quando i dati soddisfano le assunzioni di normalità.
   2. Quando tali assunzioni non sono soddisfatte, si utilizza un test U di Mann–Whitney. Si considerino differenze statisticamente significative a p < 0,05.
6. Riporta chiaramente se ogni valore mostrato corrisponde a CFU assolute, percentuali relative derivate dalla CFU o variazioni di fold calcolate dai valori assoluti della CFU.
   NOTA: Utilizzare gli stessi criteri di calcolo durante tutto lo studio per consentire un confronto diretto tra campioni di semi secchi e germogliati. Quando si presenta la composizione tassonomica, indica esplicitamente se i valori sono indicati a livello di genere o a livello di specie.

12. Punti critici di controllo qualità e risoluzione dei problemi

1. Un risciacquo finale sterile non dimostra da solo che il regime di sterilizzazione selezionato sia ottimale per l'obiettivo sperimentale. Limitare la contaminazione esterna preservando il recupero dei microrganismi coltivabili dalla frazione interna o strettamente associata al seme. Interpretare i risultati del controllo del risciacquo insieme al recupero microbico da omogeneati di semi secchi e piantini germinati.
2. Un basso recupero sia da campioni secchi che germinati può indicare una sovrasterilizzazione, omogeneizzazione eccessivamente aggressiva, condizioni di coltura inappropriate o ritardo nella lavorazione del campione. In questi casi, verificare che i tempi di sterilizzazione siano stati applicati in modo coerente, confermare che la disordinazione tissutale sia stata sufficiente ma non eccessiva e assicurarsi che diluizione, placcatura e incubazione siano state eseguite immediatamente e nelle stesse condizioni su tutti i campioni.
3. Un'elevata contaminazione nei controlli del risciacquo, o una rapida crescita eccessiva da parte di un piccolo numero di tipi di colonie, possono indicare una sterilizzazione insufficiente o una contaminazione introdotta durante la manipolazione post-sterilizzazione. In questi casi, si rivedono i tempi di sterilizzazione, i passaggi di lavaggio, la gestione asettica e l'organizzazione dei materiali all'interno della cappa a flusso laminare prima di ripetere l'esperimento.
4. Interpretare le differenze tra campioni secchi e germogliati biologicamente solo quando la fase di germinazione, la struttura della replicazione biologica, il mezzo di coltura, lo schema di diluizione, il volume di placcatura e le condizioni di incubazione sono stati standardizzati in tutto l'esperimento.
5. Quando si lavora con materiale semetale a bassa biomassa, l'apparente assenza di particolari taxa in una condizione può riflettere anche un sottocampionamento piuttosto che una vera assenza. Per questo motivo, eseguire un processo replicativo coerente e un'identificazione a livello di isolamento per interpretare in modo robusto gli spostamenti associati alla germinazione.

13. Salvare i campioni per altri approcci

1. Dopo la verifica dell'efficienza della sterilizzazione e prima della placcatura, trasferire un'aliquota aggiuntiva di 200 μL di ciascun omogeneato di seme secco o germoglio in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 mL.
2. Etichetta ogni tubo con il tipo di campione, il numero di replica biologica, la condizione di trattamento e la data di prelievo.
3. Congelare immediatamente le aliquote e conservarle a -80 °C fino all'uso nelle analisi a valle.
4. Utilizzare il materiale omogeneato immagazzinato per approcci complementari come analisi basate sul DNA, saghi basati sulla microscopia o esperimenti di conferma che richiedono la stessa replica biologica iniziale.
   NOTA: Conservare le aliquote prima della diluizione seriale e dell'impiccatura per preservare la composizione omogenea originale. Evitare cicli ripetuti di congelamento-disgelo preparando aliquote separate quando sono previste più analisi a valle.

Risultati

Prestazioni della sterilizzazione superficiale e controllo della contaminazione esterna
La sterilizzazione superficiale utilizzando condizioni standardizzate basate su metodologie precedentemente validate ha portato a una riduzione efficace della contaminazione microbica esterna, preservando al contempo il recupero dei microrganismi coltivabili da materiale derivato dai semi. La placcatura dell'acqua di risciacquo finale non ha mostrato alcuna crescita rilevabile di c...

Discussione

I risultati qui presentati dimostrano che l'integrazione della sterilizzazione standardizzata delle superfici con la germinazione controllata dei semi fornisce un quadro solido per l'isolamento culturale del microbiota associato ai semi. Un risultato chiave di questo protocollo è la capacità di bilanciare l'efficace rimozione di contaminanti esterni con la conservazione delle popolazioni microbiche endogene. Questo equilibrio è fondamentale negli studi basati su coltura, dove una sterili...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar	Sigma-Aldrich	01916-500G	Componente del terreno LB agar; 15 g/L.
Autoclave	Lab1st	SV120H	Utilizzato per sterilizzare strumenti/materiali o validare il trattamento asettico.
Kit di estrazione del DNA batterico	Promocell	PK-MB708-206-100	Estrazione del DNA
Setup per conteggio/registrazione delle colonie	OCS	B079Y5W57N	Necessario per registrare CFU, morfotipi e differenze di piastra; il manoscritto non specifica contatore/modello.
Flaconi di crioserbatoio	Sigma-Aldrich	Z359033	Implicato per la conservazione di stock in glicerolo a -80 °C; non nominato esplicitamente ma necessario per la fase di conservazione.
Sistema di registrazione digitale degli isolati	Non specificato nel manoscritto	Non applicabile	Utilizzato per registrare i metadati degli isolati: origine, replica, condizione, trattamento di sterilizzazione, data di isolamento, terreno di piastra, morfologia, stato di identificazione.
Etanolo	VWR	83813440	Usato per preparare una soluzione di etanolo 70% v/v per la sterilizzazione della superficie dei semi.
Carta da filtro	Fisher Scientific	11718772	Alternativa opzionale di supporto per la germinazione.
Forcipi/Pinzette	Sigma-Aldrich	930229	Usate per trasferire i semi e raccogliere le piantine germinanti.
Kit di estrazione del DNA genomico	PromoCell	PK-MB708-206-100	Usato per estrarre il DNA genomico da colture batteriche purificate; kit/metodo esatto non specificato.
Glicerina, sterile 80%	VWR	24388364	Mischiato 1:1 v/v con cultura liquida per la preparazione di stock criogenici.
Cappuccio di flusso laminare Bio48	Faster	LAB-CAP-22	Necessario per la manipolazione asettica dei semi, trasferimenti di sterilizzazione e preparazione di materiali sterili.
Terreno LB agar	VWR	846495000	Terreno standard utilizzato per la coltura comparativa; per litro: 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito, 10 g di NaCl, 15 g di agar.
Tubetti per microcentrifuga	Ratiolab	RATI5615000	Usati per la sterilizzazione dei semi e il trattamento dei campioni.
Terreno MS	Sigma	M0404-10L	Menzionato come supporto di germinazione sterile per germinazione assenica.
NZYTaq II 2× Master mix	Nzytech	MB35803	Miscela PCR per l'amplificazione
Parafilm	Parafilm/Merck	HS234526A	Usato per sigillare le piastre di germinazione riducendo la contaminazione.
Piatti Petri	Labbox	PDIP-E9N-500	Usati per l'allestimento della germinazione, la messa in piastra e la manipolazione dei semi sterilizzati.
Fitoagar	Duchefa Biochemie	9002-18-0	Menzionato come supporto di germinazione sterile alternativo opzionale.
Set di pipette e punta	Merck	EP3123000918-1EA	Usate per rimuovere soluzioni di sterilizzazione, lavaggio, diluizione e messa in piastra.
Terreno R2A agar	HI-MEDIA	M1743-500G	Terreno aggiuntivo opzionale per flussi di lavoro culturomici estesi.
Cloruro di sodio, NaCl	Fisher Chemical	10040460	Usato per preparare NaCl sterile 0,45% per l'omogeneizzazione e le diluizioni seriali; anche parte del terreno LB.
Ipoclorito di sodio	Carlo Erba	370323	Usato per preparare una soluzione di ipoclorito di sodio 20% v/v per la sterilizzazione della superficie dei semi. Corrosivo; richiede DPI.
Pistilli sterili monouso	Eppendorf	EP0030120973	Usati per l'omogeneizzazione di semi secchi e piantine germinanti.
Miscelatore Vortex	Fisher Scientific	15901137	Usato per risospensione di cellule microbiche dagli omogeneizzati.