Articolo di ricerca
Questo studio esplorativo su modello ratto presenta un microago attivo con scattering Raman potenziato superficiale (SERS) sensibile al redox per interventi di agopuntura simultanea e il tracciamento ratiometrico degli indici SERS legati alla capacità ossidativa locale e al potenziale redox nei ratti con tolleranza al glucosio compromessa.
La tolleranza al glucosio (IGT) compromessa è associata a un'omeostasi redox disturbata e a un aumento dello stress ossidativo, ma il monitoraggio dinamico in vivo dei cambiamenti associati al redox durante l'intervento di agopuntura rimane tecnicamente complesso. Questo studio ha sviluppato un sistema di microago attivo per scattering Raman potenziato superficiale (SERS) sensibile al redox per interventi simultanei di agopuntura e il tracciamento relativo dei SERS correlati alla capacità ossidativa (OC) e al potenziale redox (RP) nei ratti con IGT. Sonde SERS sensibili a ossidativo e redox sono state preparate funzionalizzando nanogusci d'oro (GNS) con p-fenilenamina (p-PDA) per la risposta agli OC e antrachinone per la risposta RP, rispettivamente. Le sonde sono state inserite in due scanalature incise su aghi di agopuntura per costruire microaghi attivi per SERS. In questo studio esplorativo sono stati utilizzati maschi di Sprague–Dawley privi di patogeni specifici. Tre ratti hanno fatto da controlli normali e 20 ratti sono stati nutriti con una dieta ricca di grassi e somministrati con streptozotocina (STZ) per indurre l'IGT. Dopo lo screening, 18 ratti IGT idonei sono stati divisi in gruppi a dieta ad alto contenuto di grassi e gruppi a dieta normale, con 9 ratti per gruppo dietetico. Ogni gruppo dietetico è stato ulteriormente suddiviso in sottogruppi con torsione del punto di agopuntura, torsione non del sito di agopuntura e inserimento diretto del punto di agopuntura, con 3 ratti per sottogruppo. Il needling è stato eseguito due volte al giorno per 7 giorni consecutivi, e sono stati registrati gli indici SERS correlati a digiuno (FPG), glucosio postprandiale a 2 ore (2hPG) e gli indici SERS correlati a OC e RP. I risultati hanno mostrato che il needling nei punti di agopuntura con torsione era associato a valori più bassi di FPG e 2hPG e alterava gli indici SERS correlati a OC e RP in questo modello di ratto IGT. Poiché curve di calibrazione esterne, saggi biochimici di stress ossidativo indipendenti, test di liscivia a sonda e saghi di biocompatibilità non sono stati inclusi, i rapporti SERS devono essere interpretati come indici ottici relativi associati al redox piuttosto che come concentrazioni biochimiche assolute o valori del potenziale redox assoluto. Questi risultati supportano la fattibilità dei microaghi attivi sul SERS come piattaforma preclinica esplorativa per combinare l'intervento di agopuntura con il tracciamento SERS ratiometrico locale nei ratti IGT.
La tolleranza al glucosio compromessa (IGT), ovvero una diminuzione della capacità del corpo di tollerare il glucosio, rappresenta una fase di transizione tra glicemia normale e glicemiadiabetica 1. L'IGT è quindi un segnale chiave di allarme precoce e una fase reversibile nello sviluppo del diabetedi tipo 2. I dati clinici mostrano che circa il 30% della popolazione con IGT progredirà verso il diabete di tipo 2 entro 5–10anni 3; tuttavia, con un intervento tempestivo, questa percentuale può essere ridotta a meno del 10%.
L'IGT è un processo dinamico e complesso, e un ambiente persistente ad alto contenuto di glucosio è un fattore chiave per i disturbi del metabolismoossidativo 5. Quando il corpo è in uno stato prolungato di iperglicemia, la catena respiratoria mitocondriale funziona in modo anomalo e il tasso di generazione di specie reattive di ossigeno aumenta del 30–50%, aumentando direttamente il potere ossidativonel corpo 6; Contemporaneamente, alti livelli di zucchero inibiscono l'attività di enzimi chiave, come la glutatione reduttasi, impedendo al sistema antiossidante di rimuovere tempestivamente le specie reattive di ossigeno in eccesso e alterando ulteriormente l'equilibrio ossidazione-riduzione. Inoltre, l'IGT è accompagnata da cambiamenti patologici, tra cui resistenza all'insulina e lieve distruzione della funzione β-cellulare, che danno origine a una serie di risposte biologichee biochimiche 7,8. Insieme all'evoluzione dello stato redox, questi cambiamenti aggravano ulteriormente la perturbazione del metabolismo del glucosio e aumentano il rischio potenziale di complicazioni diabetiche, tra cui retinopatia, nefropatia e malattiecardiovascolari 9,10. Pertanto, il monitoraggio della capacità ossidativa (OC) e del potenziale redox (RP) in individui o modelli animali con IGT dovrebbe migliorare la nostra comprensione dei meccanismi alla base dello sviluppo della IGT e guidare la progettazione di strategie terapeutiche mirate.
L'agopuntura ha una storia di oltre 3.000 anni e ha dimostrato buona efficacia clinica nel trattamento di molte malattie11. Inoltre, numerosi studi sperimentali su animali hanno dimostrato che l'agopuntura esercita effetti benefici nella regolazione degli stati di stress ossidativo nei modelli animali, potenziando il sistema enzimatico antiossidante e riducendo la perossidazionelipidica 12. Come pratica medica tradizionale cinese, l'agopuntura ha anche dimostrato benefici significativi nel trattamento del diabete e dell'IGT. Sono stati segnalati che i punti di agopuntura Guanyuan (CV4) e Sanyinjiao (SP6) attivano la via SIRT1/PGC-1α nel muscolo scheletrico, alleviando così la resistenza all'insulina dei topi obesidiabetici 13. Inoltre, i punti di agopuntura di Tianshu (ST25) modulano l'attività dei neuroni inibitori del glucosio situati nella regione ipotalamica laterale e contribuiscono alla regolazione del metabolismoglicolipidico 14. Tuttavia, la maggior parte degli studi sui meccanismi dell'agopuntura intravascolare si è concentrata principalmente sui sistemi neuromodulatorio, immunomodulatore e gastrointestinale, in cui l'agopuntura può influenzare il metabolismo del glucosio modulando la funzione autonoma o regolare indirettamente i livelli di glucosio nel sangue migliorando l'equilibrio della floraintestinale 15,16. Il meccanismo specifico dell'effetto dell'agopuntura nel trattamento con IGT e i suoi effetti sullo stress ossidativo sono mancati di indagini approfondite e di supporto di dati sperimentali.
La diffusione Raman potenziata dalla superficie (SERS) offre grande sensibilità e specificità, permettendo la rilevazione di una vasta gamma di analiti. Le nano-sonde SERS basate su nano-fibreottiche 17, membrane di chitosano18 e studi precedenti hanno dimostrato che gli aghi diagopuntura 19 possono essere utilizzati per la rilevazione di biomarcatori, neurotrasmettitori e altri aspetti della biochimica cellulare in vivo. Gli aghi di agopuntura, in particolare, rappresentano strumenti promettenti per i test dei tessuti profondi, permettendo un monitoraggio in situ minimamente invasivo seguito da un'analisi ex vivo. L'agopuntura, come metodo terapeutico ben consolidato, ha una gamma estremamente ampia di applicazioni cliniche. Studi recenti hanno dimostrato che fibre ottiche, medicazioni per ferite e dispositivi a microago abilitati per SERS possono supportare il tracciamento in situ o minimamente invasivo dei segnali associati al redox in contesti biologicamenterilevanti 20,21. Parallelamente, aghi di agopuntura attivi per SERS e sistemi di microaghi correlati sono emersi come promettenti portatori per integrare la capacità di rilevamento con l'interventotissutale 19, portando a microaghi attivi per SERS con risposta in vivo e capacità di rilevamento SERS in vitro.
Il presente studio si basa sulla strategia precedentemente riportata con la micro-aghi attivi SERS per rilevare segnali correlati alla capacità ossidativa e al potenziale redox nei modelli di stress indotti dalla glucosio. Tuttavia, il lavoro presente differisce dallo studio precedente sia per il contesto biologico che per lo scopo sperimentale. In particolare, questo studio applica la piattaforma a microago attivi SERS a un modello di ratto con tolleranza al glucosio compromessa e integra il tracciamento SERS proporzionale locale con l'intervento di agopuntura. Il studio attuale confronta inoltre i punti di agopuntura con siti non agopunturi adiacenti, valuta diverse manipolazioni di needling e monitora gli indici SERS associati al redox durante un periodo di intervento di 7 giorni. Rispetto alle fibre ottiche basate su SERS, medicazioni per ferite e microaghi attivi a SERS progettati principalmente per il rilevamento biochimico a sito singolo o a funzione singola, la piattaforma attuale offre due progressi. Innanzitutto, le sonde rispondenti a OC e RP sono integrate in due scanalature incise indipendenti su un singolo ago di agopuntura, consentendo il monitoraggio simultaneo dei parametri redox complementari. In secondo luogo, l'ago di agopuntura funziona non solo come portatore della sonda SERS, ma anche come dispositivo terapeutico, permettendo di effettuare il monitoraggio redox durante l'intervento di agopuntura piuttosto che dopo il trattamento. Come mostrato nella Figura 1, dopo che i microaghi sono stati inseriti nei tessuti, si formano piccole ferite e le sonde nei due scanalature reagiscono con i tessuti, permettendo loro di rilevare i livelli di OC e RP in vivo. L'obiettivo dello studio era utilizzare questi microaghi attivi nel SERS per esaminare i cambiamenti nell'OC e nella RP nei ratti con IGT e determinare gli effetti dell'agopuntura abbinata a punti di agopuntura in questi animali, ottenendo così preziose informazioni sul meccanismo degli effetti dell'agopuntura nel trattamento dell'IGT e sulla relazione tra redox e stati iperglicemici anomali.
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Animali e modelli dell'IGT
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Istituto di Ricerca dell'Università Sud-Est di Suzhou (n. di approvazione. SEU-IACUC-20250318007) e sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. I ratti sono stati raccolti e ospitati in condizioni di specifici patogeni liberi (SPF) a 25 °C con un ciclo di luce di 12 ore e 12 ore di oscurità. Per le procedure che richiedevano anestesia, i ratti venivano anestetizzati usando isoflurano somministrato in ossigeno attraverso una camera di induzione e mantenuti tramite un cono nasale. L'isoflurano è stato usato al 3% per l'induzione e all'1% per il mantenimento, con la concentrazione regolata in base alla frequenza respiratoria e alla risposta procedurale.
Una profondità anestetica adeguata è stata confermata prima di pungente o iniezione dalla perdita del riflesso di raddrizzamento e dall'assenza di risposta al pizzicamento del dito del piede. Durante l'anestesia, venivano monitorati il circuito respiratorio, la posizione corporea e il recupero, e gli animali venivano posizionati su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea. Gli animali erano ospitati 2 per gabbia con libero accesso a cibo e acqua, a meno che non fosse necessario digiunar per il test del glucosio. Dopo l'arrivo, i ratti sono stati acclimatati per una settimana prima dell'induzione del modello. Il benessere animale veniva monitorato quotidianamente, inclusi attività generali, toelettatura, assunzione di cibo, peso corporeo, condizioni del sito di iniezione e recupero dopo anestesia. Al termine dello studio, i ratti sono stati soppressi secondo il protocollo approvato per gli animali. L'eutanasia è stata eseguita tramite inalazione graduale di CO₂ a riempimento, seguita dalla conferma della morte tramite il metodo della lussazione cervicale. Gli animali che soddisfacevano i criteri umani di endpoint, tra cui grave perdita di peso, immobilità persistente, respirazione anomala, incapacità di mangiare o bere, o grave disagio, sono stati eutanasiati immediatamente invece di essere mantenuti fino al punto finale programmato. In questo studio sono stati utilizzati maschi di grado Sprague–Dawley di grado specifico e privo di patogeni specifici, con un peso di 200 ± 20 g. Dopo una settimana di acclimatazione, i ratti sono stati assegnati casualmente in due gruppi: i tre ratti del gruppo normale sono stati nutriti con cibo normale, mentre i 20 ratti del gruppo modello sono stati nutriti con cibo ad alto contenuto di grassi (50% cibo basale + 10% strutto + 25% saccarosio + 15% polvere di tuorlo) per 3 settimane. Gli animali del gruppo modello hanno ricevuto iniezione intraperitoneale di 20 mg/kg di soluzione STZ al 2% (solubilizzata in 0,1 mol/L, pH 4,4 citratto tampone) per 12 ore, dopo 12 ore di digiuno senza restrizione idrica. Coloro che appartenevano al gruppo normale ricevevano un'iniezione intraperitoneale della corrispondente dose di soluzione tampone di citrato dopo essere stati nutriti con cibo normale. Un test di tolleranza al glucosio intraperitoneale (IPGTT) è stato eseguito una settimana dopo. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.
La glicemia a digiuno (FPG) è stata misurata tramite prelievo di sangue dalla punta della coda di ratti in ciascun gruppo dopo 12 ore di digiuno senza restrizione idrica, e 2 ore di glucosio postprandiale (2hPG) sono state registrate dopo l'iniezione intraperitoneale di destrosio al 20% 20% 2 g/kg. Nel gruppo normale, l'intervallo FPG era di 5,1–6,6 mmol/L, mentre quello di glucosio di 2hPG era 7,3–9,4 mmol/L, rispetto a un FPG di ≤7,0 mmol/L e un intervallo di 2hPG di 10–16 mmol/L nel gruppo modello. Dei 20 ratti assegnati all'induzione modello IGT, 18 soddisfarono i criteri predefiniti dell'IGT dopo l'IPGTT e furono inclusi nell'esperimento di intervento successivo. Due ratti sono stati esclusi perché i loro valori FPG o 2hPG erano fuori dal range IGT predefinito. I 18 ratti ammessi sono stati poi assegnati casualmente a un gruppo a dieta ricca di grassi e a uno a dieta normale, con 9 ratti per gruppo. Ogni gruppo dietetico è stato ulteriormente suddiviso in tre sottogruppi: torsione del punto di agopuntura, torsione non del sito di agopuntura e inserimento diretto del punto di agopuntura, con tre ratti per sottogruppo. Si trattava di uno studio esplorativo di sviluppo di metodi progettato per valutare la fattibilità di combinare l'intervento con l'agopuntura con il tracciamento ratiometrico basato su SERS in un modello preclinico di ratti IGT. Non è stato effettuato alcun calcolo formale della potenza statistica. La dimensione del sottogruppo di tre ratti è stata selezionata sulla base della fattibilità, degli studi preliminari SERS-microago e del principio di riduzione animale. I ratti venivano assegnati casualmente dall'esperimento; Non furono eseguiti occultamenti formali e accecamento.
I protocolli di trattamento con agopuntura sono stati esaminati facendo riferimento alle linee guida cliniche basate sull'evidenza per la medicina tradizionale cinese e alla fattibilità degli esperimenti suglianimali 22. I punti di agopuntu selezionati sono stati Zhongwan (RN12/CV12), Shuifen (RN9/CV9), Yinjiao (RN7/CV7), bilaterale Tianshu (ST25), bilaterale Shuidao (ST28) e bilaterale Zusanli (ST36). RN12, RN9 e RN7 erano localizzati sulla linea medio-anteriore e trattati come singoli punti della linea mediana, mentre ST25, ST28 e ST36 sono stati trattati bilateralmente. Le coppie dei punti di agopuntura si basavano su quelle utilizzate per il trattamento clinico diIGT 23. L'adattamento si basava sulla letteratura24,25, utilizzando il metodo dicotomico. Per i ratti, i punti di agopuntura sono stati localizzati in base a punti di riferimento anatomici e conversione proporzionale rispetto alle posizioni standard dei punti di agopuntura umani. I punti addominali RN/CV sono stati identificati lungo la linea medio-anteriore utilizzando il processo xifoide, l'ombelico e la simfisi pubica come punti di riferimento anatomici. ST25 è stata segnata bilateralmente a livello ombelicale e ST28 è stata contrassegnata bilateralmente nella regione inferiore dell'addome, alla stessa distanza laterale dalla linea medio-anteriore. ST36 è stato identificato sul ramo posteriore anterolaterale nella regione tibiale anteriore, lateralmente al tubercolo tibiale. I siti di confronto adiacenti non legati all'agopuntura erano contrassegnati a 5 mm laterali rispetto ai corrispondenti punti di agopuntura e al di fuori della linea meridiana riconosciuta, evitando però vasi visibili, cicatrici e precedenti punti di puntura. Prima dell'agunciamento, i ratti venivano anestetizzati con isoflurano secondo il protocollo approvato per animali e posizionati in posizione supina su un cuscinetto riscaldante. La pelle addominale e posteriore sopra ciascun sito bersaglio è stata rasata e disinfettata con il 75% di etanolo. Microaghi attivi per SERS sono stati inseriti approssimativamente perpendicolari alla pelle fino a una profondità di circa 10 mm. Per i gruppi di torsione dei punti di agopuntura, microaghi attivi per SERS sono stati inseriti nei punti selezionati e ruotati delicatamente in modo bidirezionale durante il periodo di ritenzione di 20 minuti. Per i gruppi non basati sul sito di agopuntura, la stessa procedura è stata eseguita nei punti di confronto non agopuntura adiacenti a 5 mm. Per i gruppi a inserimento diretto, microaghi attivi SERS sono stati inseriti nei punti di agopuntura e trattenuti per 20 minuti senza torsione. Tutte le procedure di needling venivano eseguite dallo stesso operatore addestrato per minimizzare la variazione tra operatori.
Il needling veniva eseguito due volte al giorno, alle 10:00 e alle 15:00, per 7 giorni consecutivi. Prima di ogni procedura giornaliera, la FPG veniva misurata dopo 8 ore di digiuno senza restrizione idrica. Dopo ogni procedura giornaliera di needling, sono state registrate le risposte di OC e RP. Il giorno 7, dopo il trattamento di agopuntura, è stata eseguita la IPGTT e sono stati registrati valori di 2hPG.
Precauzioni
La streptozotocina è pericolosa e dovrebbe essere trattata come una sostanza chimica tossica. Prepara la soluzione di streptozotocina in una cappa chimica o in un armadietto certificato per la biosicurezza, indossando un camice da laboratorio, guanti di nitrilo, occhiali protettivi e mascherina. Siringhe, aghi, salviette, lettieri, gabbie e rifiuti animali contaminati da streptozotocina devono essere maneggiati secondo le procedure istituzionali di rifiuti biologici e chimici pericolosi. Gli aghi e le siringhe usati devono essere gettati immediatamente in contenitori per pezzi taglienti resistenti a punture senza ricappiare.
Fabbricazione di microaghi attivi SERS per la rilevazione di OC e RP
Sono stati preparati aghi per agopuntura come precedentementeriportato 26. Durante lo studio, microaghi attivi per SERS sono stati realizzati utilizzando lo stesso tipo di aghi commerciali in acciaio inox (0,25 mm × 26 mm). Gli aghi venivano inseriti approssimativamente perpendicolarmente alla pelle fino a una profondità di 10 mm. Per i gruppi di torsione, la rotazione bidirezionale manuale è stata applicata in modo delicato e costante per 20 minuti durante il periodo di ritenzione dallo stesso operatore addestrato. La manipolazione non era controllata dallo strumento; pertanto, la frequenza e l'ampiezza esatte della rotazione non sono state quantificate. Questa limitazione è stata riconosciuta nella Discussione.
Inizialmente, gli aghi sono stati immersi in una soluzione PMMA al 20% (p/v) in MMA, seguiti dall'asciugatura a temperatura ambiente (25 °C) per 1 giorno. Successivamente, furono realizzate due rientranze parallele di dimensioni uniformi e forma e profondità simili nello strato protettivo PMMA (distanti 5 mm) utilizzando una piccola lama da coltello da artigianato pulita con etanolo; poi, gli aghi venivano immersi in acido solforico da 0,5 M che fungeva da elettrolita per 10 secondi per sottoporsi all'incisione elettrochimica a una tensione di 12 V, generando così due scanalature quasi circolari nei punti di incisione. In terzo anno, dopo aver risciacquato tre volte, gli aghi sono stati immersi a temperatura ambiente per 24 ore in una soluzione etanolica contenente 0,1 mol L−1 MPTES e 0,3 mol L−1 APTES, conferendo così una funzionalità solfidril alle superfici scanalate. Quarto, il rivestimento è stato rimosso immergendo l'ago nella MMA. Microaghi SERS-attivi a risposta al potenziale redox sono stati preparati basandosi su un metodoprecedentemente riportato 27. Il substrato SERS veniva adsorbito su una delle scanalature incise di ciascun ago di agopuntura, dopo di che i microaghi attivi SERS risultanti venivano immersi in una soluzione acquosa di p-PDA a una concentrazione di 1 × 10-4 mol/L per 60 minuti a 37 °C, producendo microaghi SERS attivi e sensibili all'ossidazione. I substrati SERS basati su nanogusci d'oro sono stati sintetizzati come descrittoin precedenza, 28. Nel presente lavoro, questi microaghi venivano inseriti nell'altra scanalatura di ciascun ago di agopuntura, che poi venivano lasciati asciugare naturalmente. Questo ha prodotto microaghi attivi per SERS con risposta a OC e RP.
Valutazione ex vivo della risposta a OC e RP ai microaghi attivi nel SERS
Le risposte delle sonde OC e RP sono state valutate inserendo i microaghi attivi nel SERS nel tessuto ex vivo. Per verificare la reattività della sonda OC ai cambiamenti ossidativi, sono stati registrati spettri SERS di p-PDA prima e dopo l'ossidazione. Spettri delle sonde redox SERS sono stati acquisiti anche in una soluzione fortemente riducente diNaBH 4 e in una soluzione fortemente ossidante di HAuCl4. La selettività della sonda OC è stata valutata utilizzando agenti riducenti, tra cui 1 × 10-4 MFeSO 4, 1 × 10-4 M Na 2SO4 e 1 × 10-4 M acido ascorbico, e agenti ossidanti, inclusi 1 × 10-4 MCuSO 4, 1 × 10-4 MH 2O 2, 1 × 10-4 MFeCl 3, e 1 × 10-4 M HAuCl4. Tutte le soluzioni sono state preparate in 20 mM PBS (pH 7,4), e le sonde sono state incubate con ciascuna soluzione per 20 minuti a 37 °C. La robustezza dei microaghi attivi per SERS è stata valutata registrando le risposte OC prima e dopo la reazione con 1 × 10-4 mol/L FeCl3 a temperatura ambiente. Questi test ex vivo e basati su soluzione sono stati utilizzati per confermare la risposta della sonda in condizioni controllate. Tuttavia, non riproducono completamente la complessità del microambiente tissutale in vivo, dove variazioni locali del pH, adsorbimento proteico, componenti della matrice extracellulare e altre sostanze biologiche possono influenzare i segnali SERS. Pertanto, le letture in vivo di OC e RP sono state interpretate come indici SERS relativi associati al redox piuttosto che come misurazioni biochimiche indipendenti dalla matrice.
Rilevamento di OC e RP nei siti di agopuntura e non agopuntura
Per valutare le prestazioni delle sonde OC e RP nei punti di agopuntura e nei punti non agopuntura, i microaghi attivi per SERS sono stati inseriti in ratti sani ai punti di agopuntura ST36 e RN12, e a 5 mm adiacenti a ciascuno di questi punti, a una profondità di circa 10 mm, per lo stesso intervallo di tempo.
Effetti della torsione dell'ago sul rilevamento di OC e RP
Per valutare la reattività delle sonde OC e RP sotto diverse tecniche di needling, sono stati inseriti microaghi attivi per SERS nei punti di agopuntura ST36 e RN12 e 5 mm adiacenti a questi punti nei ratti sani, fino a una profondità di circa 10 mm. In ogni punto di agopuntura, un ago veniva torto, mentre l'ago corrispondente adiacente alla punta no, e viceversa (un ago adiacente al punto di agopuntura veniva torto, mentre il suo corrispettivo al punto di agopuntura no). I segnali SERS delle sonde sono stati raccolti nello stesso tempo di inserimento per ciascun ago.
Cambiamenti nell'OC e nella RP nei ratti con IGT riguardo ai punti di agopuntura, torsioni dell'ago e condizioni alimentari
Per valutare gli effetti dei punti di agopuntura, della torsione dell'ago e delle condizioni alimentari su OC e RP dei ratti con IGT, i ratti del gruppo con dieta ricca di grassi sono stati assegnati casualmente a tre gruppi (A1, A2 e A3; tre ratti per gruppo), così come quelli del gruppo della dieta normale (gruppi B1, B2 e B3; tre ratti in ciascun gruppo). Per i ratti dei gruppi A1 e B1, microaghi attivi per SERS venivano inseriti nei punti di agopuntura dopo la sedazione e torsionati per 20 minuti; la stessa procedura fu eseguita per i ratti nei gruppi A2 e B2, tranne che i microaghi furono inseriti a 5 mm adiacenti ai punti di agopuntura. Per i ratti in A3 e B3, i microaghi attivi per SERS venivano inseriti nei punti di agopuntura del ratto senza torsione; Gli aghi sono stati lasciati al loro posto per 20 minuti. Il needling veniva eseguito due volte al giorno, alle 10:00 e alle 15:00, per 7 giorni. Prima di ogni procedura giornaliera, veniva utilizzato un glucometro per registrare i valori FPG per ogni gruppo di ratti (dopo il digiuno ma senza restrizione d'acqua per 8 ore). Dopo ogni giorno di needling, sono state misurate e registrate le risposte a OC e RP. Al giorno 7, dopo l'agopuntura, è stata eseguita la IPGTT su ciascun gruppo di ratti e sono stati registrati valori di 2hPG.
Caratterizzazione e misurazione
La morfologia dei microaghi attivi per SERS è stata esaminata con microscopia elettronica a scansione (SEM). Gli spettri SERS sono stati acquisiti a 25 °C, utilizzando uno spettrometro Raman configurato con un obiettivo a distanza di lavoro lunga del 50× (NA: 0,5) e un laser da 785 nm. Per tutte le misurazioni, il tempo di acquisizione era di 10 s, e il sistema Raman operava a una potenza laser nominale di 600 μW con la stessa configurazione ottica. La potenza laser effettiva fornita sulla superficie tissutale non è stata misurata direttamente in questo studio. Pertanto, gli spettri SERS sono stati utilizzati per confronti relativi tra gruppi sotto impostazioni di acquisizione identiche, e non sono state traccolte conclusioni riguardo alla sicurezza fototermica assoluta dei tessuti. I rapporti di intensità di due sonde SERS sono stati calcolati con il seguente approccio: il rapporto tra i valori di intensità a 1450 cm−1 e quello a 1500 cm−1 è stato designato come indicatore per OC (I1450 cm−1/I1500 cm−1), dopo aver sottratto l'intensità a 1700 cm−1 (come sfondo ) da ciascuno dei due picchi, rispettivamente, come nei rapporti precedenti 17; e usando I1606 cm−1/I1666 cm−1 come indicatore di RP, l'intensità a 1700 cm−1 (come sfondo ) veniva sottratta da ciascuno dei due picchi, rispettivamente. I valori calcolati diI 1450 cm−1/I1500 cm−1 e I1606 cm−1/I1666 cm−1 sono stati analizzati come indici relativi derivati dal SERS delle risposte associate a OC e RP, rispettivamente. Questi rapporti venivano utilizzati per confrontare i cambiamenti tra gruppi e momenti temporali con impostazioni di acquisizione identiche.
Nel presente studio non è stata stabilita alcuna curva di calibrazione esterna per convertire questi rapporti in concentrazioni assolute di specie ossidative o valori di potenziale redox elettrochimico assoluto. Ogni spettro è stato registrato due volte in cinque punti diversi della sonda SERS in tre campioni replicati. Origin veniva utilizzato per elaborare dati e produrre grafici. Per minimizzare la variabilità legata all'acquisizione, sono stati applicati a tutti i gruppi la stessa lunghezza d'onda laser, obiettivo, tempo di acquisizione, impostazione della potenza laser e flusso di lavoro di elaborazione spettrale. I potenziali effetti fototermici o fotochimici causati dall'irradiazione laser non sono stati quantificati indipendentemente e sono riconosciuti come una limitazione. I dati statistici sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). La dimensione del campione e il test statistico utilizzato per ogni esperimento o pannello di figure sono specificati nelle relative legende delle figure. Per esperimenti di validazione ex vivo della sonda, la sonda SERS o microago preparato indipendentemente veniva utilizzato come unità di analisi. Per le analisi in vivo della glicemia e dell'indice SERS, il ratto è stato utilizzato come unità di analisi biologica. Gli spettri raccolti da più punti della stessa sonda sono stati trattati come misurazioni tecniche e mediati prima dell'analisi a livello di gruppo. Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software SPSS. I confronti tra i gruppi sono stati effettuati utilizzando i test statistici indicati nelle relative leggende delle figure. Le misurazioni seriali di glucosio a digiuno e indice SERS durante il periodo di intervento di 7 giorni sono state interpretate come tendenze longitudinali esplorative a causa della piccola dimensione dei sottogruppi, e non è stato applicato alcun modello formale di misure ripetute o effetti misti. La significanza statistica è stata definita come p < 0,05. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.
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Fabbricazione di microaghi attivi SERS per la rilevazione di OC e RP
Per identificare i cambiamenti in OC e RP, sono stati fabbricati microaghi attivi SERS contenenti le sonde corrispondenti. Immagini rappresentative SEM confermarono la struttura a due scanalature dei microaghi attivi nel SERS. La Figura 2A mostra il corpo dell'ago di agopuntura con due scanalature incise, la Figura 2B
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La tolleranza al glucosio compromessa rappresenta una fase transitoria reversibile prima del diabete di tipo 2 ed è strettamente associata a squilibri metabolici, resistenza all'insulina e disregolazione legata allo stress ossidativo. L'intervento nello stile di vita e altre strategie terapeutiche precoci possono ridurre il rischio di progressione da tolleranza al glucosio compromessa al diabete, ma gli strumenti per monitorare dinamicamente le risposte biochimiche locali durante l'inter...
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Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi.
Gli autori ringraziano il personale delle strutture animali e delle piattaforme di imaging per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dai principali progetti di ricerca e sviluppo della provincia del Jiangsu sulla medicina cinese (2020ZX05), dai principali progetti di ricerca e sviluppo della provincia del Jiangsu (BE2022684), dal Progetto Scienza e Tecnologia dell'Amministrazione Statale per la Regolamentazione dei Mercati (2022MK158) e dalla fondazione Scienza-Tecnologia di Suzhou (SYW2024031).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES, 98%) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | A800524 | |
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTES, 95%) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | M742544 | |
| Ascorbic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | CFAD310554 | |
| Blood glucose meter | Cofoe Medical Technology Co., Ltd. | Cofoe A03 | |
| Blood glucose test strips | Cofoe Medical Technology Co., Ltd. | Cofoe-A03-C | |
| Copper sulfate (CuSO4) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | PHR1477 | |
| Ethyl alcohol (≥99.7%) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | XW00641752 | |
| Ferrous sulfate (FeSO4) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | XW01772078701 | |
| Glucose (Glu) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | D9434 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | P-17-0500 | |
| Iron chloride (FeCl3) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | CP81015228 | |
| Methyl methacrylate (MMA) | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd. | M109626 | |
| Micro-Raman spectrometer | Renishaw | InVia Raman Microscope | |
| p-Phenylenediamine (p-PDA) | Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd. | P128784 | |
| Polymethyl methacrylate (PMMA) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | P742581 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | ULTRA Plus | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd. | S432207 | |
| Sodium sulfite (Na2SO4) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | S572396 | |
| Stainless steel acupuncture needles | Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd. | X-20-03 | |
| Statistical analysis software | International Business Machines Corporation | Version 2021 | |
| Streptozotocin (STZ) | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd. | S408311 | |
| Tetrachloroauric acid (HAuCl4) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | A124024 | |
| SPSS software | International Business Machines Corporation, Armonk, New York State, USA | version 26.0 | |
| rats | Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd. | Specific-pathogen-free male Sprague-Dawley | |
| basal chow | Anuokang Biotech. | SY10001 | |
| Lard | MCE | HY-W127601 | |
| Sucrose | MCE | HY-B1779 | |
| Egg yolk powder | MCE | HY-B2235B | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Citrate buffer | beyotime | P0086 | |
| Phosphate-buffered saline | beyotime | ST448-1L | |
| Isoflurane | Bioss | D54468 | |
| Small-animal isoflurane anesthesia system | RWD Life Science | R500 | |
| Induction chamber and nose cone | RWD Life Science | R500compatible accessories | |
| Warming pad | Shanghai Yuyan Life Science | Y69020 | |
| 75% ethanol | Boyu Bio. | YB60401 | |
| CO2 euthanasia chamber | Lab Animal Tec. Co. | LAT-10-0090 | |
| WPS | Beijing Kingsoft Office Software | WPS365 |
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