Metodi elettrofisiologici per la registrazione Potenziali Synaptic dal NMJ Larve di Drosophila

Per ottenere registrazioni elettrofisiologiche stabili dalle giunzioni neuromuscolari della larva di Joof, si procede innanzitutto alla dissezione della larva per esporre la parete corporea, i muscoli e il sistema nervoso prima della registrazione. Gli assoni alla base del sistema nervoso centrale vengono recisi posteriormente al ganglio ventrale.

Quindi un elettrodo di registrazione viene posizionato sul muscolo di interesse e un elettrodo stimolante viene collocato vicino ai motoneuroni innervanti. Gli assoni recisi dei motoneuroni vengono aspirati all'interno della pipetta stimolante. Successivamente, possono essere registrati i potenziali di giunzione eccitatori.

Ciao, sono Wendy MLA del laboratorio McCabe del Dipartimento di Fisiologia e Biophysics cellulare presso la Columbia University. Oggi vi mostreremo un procedimento per misurare la trasmissione tic alla giunzione neuromuscolare della GE lava. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la fisiologia sinaptica e la neurotrasmissione.

Iniziamo. Per iniziare l'esperimento, dissezionare larve di terzo stadio e larve star per esporre la parete corporea. Questo protocollo è stato modificato per esperimenti elettrofisiologici utilizzando spilli da dissezione corti.

Questi hanno una lunghezza compresa tra due e quattro millimetri e hanno minori probabilità di colpire l'obiettivo del microscopio negli elettrodi durante l'esperimento. Dopo aver esposto la parete corporea, utilizzare una pinzetta per tenere il sistema nervoso centrale e sollevarlo leggermente. Quindi tagliare gli assoni motori dei nervi periferici ed eliminare il cervello.

Dopo aver rimosso il cervello, lavare due volte il preparato dissezionato con tampone HL 3.1 contenente un millimolare di calcio. Ora che la dissezione è completa, è possibile effettuare registrazioni intracellulari dalle cellule muscolari della larva. Posizionare la piastra di dissezione sul microscopio per elettrofisiologia e immergere il preparato nel tampone HL 3.1 con calcio.

Quindi fissare l'elettrodo del bagno in modo che sia a contatto con la soluzione. L'elettrodo a sifone viene utilizzato per stimolare i nervi periferici che innervano il muscolo. Posizionare prima l'elettrodo a sifone nella piastra per evitare vibrazioni quando l'elettrodo intracellulare viene appoggiato sul muscolo.

Una volta posizionato l'elettrodo nella piastra, avvicinarlo al neurone motore che innerva il muscolo sei. Nel terzo segmento addominale, applicare un'aspirazione delicata finché il nervo reciso non è all'interno della pipetta di vetro. Prestare attenzione a non stirare i nervi durante l'applicazione dell'aspirazione.

Sollevare leggermente la pipetta in modo che non tocchi il muscolo. Quindi posizionarla in modo che non tiri sulle fibre nervose recise. Una volta posizionato l'elettrodo a risucchio, posizionare l'elettrodo di registrazione per le registrazioni intracellulari.

Utilizzare un microelettrodo affilato riempito con cloruro di potassio tre molare. Posizionare l'elettrodo di registrazione al centro del muscolo sei. Regolare l'offset in ingresso in modo che indichi zero per la soluzione del bagno.

Abbassare lentamente l'elettrodo e avvicinarsi al muscolo con un'elevata ingrandimento ottico fino a quando non tocca la superficie muscolare. Per confermare che il muscolo sia stato penetrato, osservare l'oscilloscopio. Il potenziale di membrana a riposo dovrebbe essere di almeno -60 millivolt.

Dovrebbero ora essere visibili potenziali in miniatura sporadici. Una volta posizionato l'elettrodo di registrazione, lasciare stabilizzare le cellule per un minuto. Prima di iniziare le registrazioni, utilizzare un amplificatore Axon HS-2 con una testa elettrodica (head stage) e un morsetto per amplificatore AxoClamp 2B per rilevare le variazioni del potenziale di membrana.

Il morsetto dell'assale due B è collegato a un computer che esegue il software P clamp attraverso i dati digitali. 1322 A, che digitalizza il segnale. Registrare il potenziale di membrana su un PC. Con il software clamp X, applicare stimoli all'assone motorio per generare potenziali di membrana eccitatori o ejs.

Dopo aver generato i potenziali postsinaptici endogeni (ejs), registrare i potenziali miniaturizzati per un periodo di tre minuti senza stimoli alla sinapsi. Il software di analisi mini può essere utilizzato per analizzare i tracciati e determinare l'ampiezza e la frequenza del potenziale postsinaptico endogeno miniaturizzato (EJP). Per generare i potenziali postsinaptici endogeni (ejs).

Utilizzare un generatore di impulsi maestro a otto impulsi per stimolare l'estremità recisa di un programma di neurone motorio. Il generatore deve erogare impulsi di tensione quadrati della durata di 0,3 millisecondi. Un intervallo di cinque secondi tra uno stimolo e l'altro per consentire il recupero sinaptico.

Al livello della giunzione neuromuscolare, registrare almeno 10 potenziali evocati da ciascun muscolo e calcolare la media delle ampiezze. Questa figura mostra un tracciato tipico registrato dal muscolo sei di una larva di sal di tipo selvatico, con risposte EJP evocate e potenziali mini-EJP spontanei. Vi abbiamo appena mostrato come registrare potenziali elettrici dalla giunzione neuromuscolare della larva di Drosophila. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di completare la dissezione entro tre-dieci minuti e di iniziare immediatamente le registrazioni elettrofisiologiche mentre le cellule sono ancora sane e reattive.

Se la dissezione richiede troppo tempo, il potenziale di membrana a riposo delle cellule muscolari sarà inferiore a meno 60 millivolt, valore troppo basso per poter essere registrato. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.