Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

Questa procedura inizia con la preparazione dell'mRNA cap trascritto in vitro e del morpholino. Una pipetta micrometrica viene riempita aspirando la soluzione contenente il morpholino e il volume di iniezione viene quindi calibrato utilizzando un micrometro allo stadio a una cellula. Gli embrioni di pesce zebra vengono quindi raccolti e disposti in una camera per microiniezioni per iniezioni nel tuorlo.

La soluzione di lavoro viene iniettata nel tuorlo appena al di sotto della cellula e i movimenti citoplasmatici vengono sfruttati per trasportare la soluzione per le microiniezioni cellulari. Iniettare la soluzione nel citoplasma cellulare dopo le iniezioni. Incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius in mezzo E3 e valutare i fenotipi di interesse negli stadi successivi.

Ciao, sono Shiloh Yuen del laboratorio, figlio del dottor Sasha e del Dipartimento di Genetica della Yale University School of Medicine. Oggi illustreremo una tecnica affidabile di microiniezione per eseguire studi di sovraespressione di mRNA e di silenziamento genico mediante oligonucleotidi morfologici nel pesce zebra. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare il ruolo del S cilium nelle malattie renali cistiche.

Iniziamo. Un approccio potente per lo studio della funzione genica consiste nell'iniettare per microiniezione RNA capped trascritto in vitro in embrioni di pesce zebra. In questa dimostrazione, eseguiremo la microiniezione di un trascritto marcato con EGFP e utilizzeremo l'espressione di GFP in embrioni interi vitali come indicatore visibile di un'iniezione riuscita.

Per prima cosa, eseguiremo una reazione di trascrizione in vitro dell'RNA con cap sul trascritto di interesse. Nel nostro laboratorio, inseriamo abitualmente l'A-C-D-N-A di interesse in un vettore PCs two plus ed effettuiamo una reazione di sintesi in vitro per ottenere grandi quantità di RNA capato utilizzando il kit M message M machine SP six. Successivamente, purificheremo il campione di RNA mediante il kit RN easy mini kit oppure mediante estrazione con fenolo-cloroformio e precipitazione con isopropanolo.

Determinare con attenzione la concentrazione della preparazione di RNA e conservarla a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso nel giorno dell'iniezione. Scongelare il campione di RNA, vortexare delicatamente e centrifugare brevemente. Preparare ora una soluzione lavorativa con acqua sterile e una concentrazione finale di 0,025-0,05% di rosso fenolo; il rosso fenolo funge da marcatore visibile per l'iniezione della soluzione nell'embrione.

Qui prepareremo una soluzione lavorativa di 100 nanogrammi per microlitro di mRNA di EGFP con lo 0,05% di rosso fenolo. Infine, mantenere il campione lavorativo sul ghiaccio e riporre la scorta di RNA a meno 80 gradi Celsius. Procedere alla preparazione del morpho quando si è pronti per iniettare questo campione.

Gli oligonucleotidi antisenso Morino sono ampiamente utilizzati per modificare l'espressione genica bloccando la traduzione di una proteina bersaglio o modificando lo splicing dell'RNA prematuro. I morphos nel pesce zebra costituiscono uno strumento genetico inverso potente, in grado di ridurre la funzione genica. Qui eseguiremo un'iniezione microscopica di un oligo morpho diretto al sito di inizio della traduzione di pkd2. Utilizziamo regolarmente 300 M di un oligo morpho, progettato specificamente per un gene di interesse e ottenuto da Gene Tools LLC.

Successivamente, aggiungiamo 100 microlitri di acqua sterile per ottenere una soluzione madre da tre millimolari, quindi aliquote la soluzione e la conserviamo a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso nel giorno dell'iniezione. Riscaldiamo la soluzione morino a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Poi raffreddiamo immediatamente la soluzione in ghiaccio e centrifughiamo brevemente; questo passaggio denatura eventuali strutture secondarie nell'oligo e garantisce che la soluzione sia completamente solubilizzata.

Successivamente, prepareremo una soluzione lavorativa diluendo la soluzione Morpho in acqua sterile fino a una concentrazione finale di 0,025-0,05% di rosso fenolo. In questo dimostrativo, prepareremo una soluzione lavorativa di 0,5 millimolare di PKD due morino con 0,05% di rosso fenolo. Mantenere la soluzione lavorativa a temperatura ambiente e procedere al riempimento della micropipetta quando si è pronti per iniettare questo campione.

Per iniziare, sarà necessario fabbricare delle micropipette da utilizzare per le iniezioni. Questo viene fatto riscaldando e tirando tubi capillari in vetro silicato BOS in un dispositivo polarizzatore per micropipette. Una volta tirate, le micropunture vengono conservate in una capsula di Petri sopra una piccola quantità di argilla o nastro adesivo.

Successivamente, prepareremo le piastre per la camera di microiniezione versando l'agarosio al 1,5% in piastre di mezzo XE tre modellate con solchi a forma di cuneo. Questo costituirà un metodo semplice per trattenere gli embrioni durante l'iniezione. Le piastre della camera in agarosio vengono quindi lasciate solidificare e conservate a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Per iniziare a riempire la micropipetta, tagliare la punta distale con pinzette o una lama chirurgica per creare un'apertura appena visibile al microscopio stereoscopico con un ingrandimento di 50 x. Successivamente, posizionare due microlitri della soluzione lavorativa.

Come goccia su un coprioggetto, fissare la parte posteriore di una micropipetta a una siringa da cinque millilitri dotata di tubo su un ago ipodermico e immergere leggermente la punta distale della micropipetta nella goccia della soluzione di lavoro. Prestare attenzione a non rompere la punta della micropipetta. Aspirare la soluzione di lavoro attraverso l'estremità distale della micropipetta tirando lo stantuffo della siringa.

Successivamente, calibreremo il volume di iniezione della micropipetta. Posizionare una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico e accendere l'alimentazione e l'aria compressa dell'apparato di microiniezione a impulsi di pressione. Quindi, collegare la micropipetta al supporto della micropipetta dell'apparato di microiniezione.

L'iniettore micro è regolato dalla pressione e le erogazioni vengono attivate premendo il pedale sotto il microscopio stereoscopico. Verificare il volume di iniezione utilizzando l'iniettore micro per depositare una goccia della soluzione in uso sull'olio del micrometro. Misurare il diametro della goccia mentre galleggia come una sfera sulla superficie dell'olio.

Regolare la durata e la pressione dell'iniezione per calibrare con precisione il volume di iniezione. Questo passaggio contribuisce alla riproducibilità dell'esperimento di microiniezione. In questa dimostrazione, tutte le microiniezioni verranno eseguite con un diametro della goccia di 0,15 millimetri.

Infine, una volta calibrato il volume di iniezione, utilizzare la manopola di blocco sulla micropipetta per evitare il riempimento inverso e le perdite della micropipetta. Ora è il momento di preparare gli embrioni di pesce zebra. I pesci zebra si accoppiano casualmente nelle prime ore di ogni mattina; per iniziare la preparazione, raccogliere gli embrioni allo stadio ad una singola cellula e posizionarli in un mezzo 1 XE tre.

Utilizzando una pipetta di trasferimento da tre millilitri, posizionare gli embrioni lungo le scanalature a forma di cuneo nelle piastre della camera di microiniezione. Rimuovere il mezzo in modo che gli embrioni siano leggermente immersi e non sommersi. Questo passaggio facilita l'assestamento degli embrioni sul fondo delle scanalature e la penetrazione del corione da parte della micropipetta.

Ora inizieremo le iniezioni. Per prima cosa, manipoleremo gli embrioni con la micropipetta in modo che il citoplasma dell'embrione allo stadio ad una cellula sia visibile al microscopio stereoscopico. Fare attenzione a non rompere la punta della micropipetta, penetrare la coriona e quindi il tuorlo con la micropipetta per effettuare l'iniezione nell'embrione.

In questa dimostrazione, effettueremo innanzitutto un'iniezione microscopica nel tuorlo direttamente al di sotto della cellula, lasciando che il citoplasma e la diffusione portino la soluzione di lavoro all'interno della cellula. Questo flusso è visibile grazie al rosso fenolo aggiunto alla soluzione di lavoro. Poiché si tratta di un embrione monocellulare, può essere iniettato manualmente o con un manipolatore.

Illustreremo anche l'iniezione diretta nel citoplasma della cellula. La microiniezione diretta nella cellula è più efficace, ma richiede più tempo poiché è necessaria un'adeguata orientazione dell'embrione e una tecnica di microiniezione precisa. Poiché la membrana cellulare è più resistente della membrana del tuorlo, spesso è più rapido far entrare la micropipetta attraverso il tuorlo per raggiungere la cellula.

L'orientamento del citoplasma con il polo animale rivolto verso il fondo della scanalatura e il lavorare con mani ferme possono facilitare questo metodo di iniezione. Dopo la microiniezione, posizionare gli embrioni in una piastra di Petri con mezzo E3 e incubarli a 28,5 gradi Celsius per uno sviluppo normale. Nelle ore e nei giorni successivi dello sviluppo embrionale, osservare gli embrioni per i fenotipi di interesse.

Per verificare il successo della microiniezione, monitoreremo l'espressione di GFP negli embrioni in via di sviluppo a partire dalla fase shield mediante microscopia a fluorescenza su tutto l'embrione in vivo. L'espressione del costrutto è più intensa durante i primi eventi dello sviluppo embrionale e spesso diminuisce nel corso dello sviluppo, poiché l'RNA capped iniettato viene gradualmente degradato e dipende dalla stabilità della proteina espressa. Sulla base di risultati precedentemente pubblicati, ci aspettiamo che la morfina PKD due imiti la curvatura dell'asse corporeo dorsale osservata nei zebrafish mutanti per PKD due e presenti cisti renali a circa due-tre giorni post-fecondazione.

Vi abbiamo appena mostrato una tecnica robusta di microiniezione per eseguire studi di sovraespressione di mRNA e di silenziamento genico mediante oligonucleotidi morfologici nel pesce zebra; quando eseguite questa procedura, ricordate che è importante iniettare con mano ferma. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.