Misura Caenorhabditis elegans Life Span su terreni solidi

Per misurare la durata della vita in C. elegans, si genera una popolazione sincronizzata per età mediante un incrocio temporizzato delle uova. Vermi ermafroditi adulti attivi vengono trasferiti su piastre di terreno di crescita per nematodi seminate con E. coli inattivato mediante raggi UV, lasciati deporre le uova per sei-otto ore e poi rimossi. Nei due giorni successivi, i vermi schiudono da queste uova e crescono fino allo stadio larvale L4. I vermi L4 vengono trasferiti su nuove piastre NGM contenenti ampicillina per prevenire contaminazioni batteriche vive e FUDR per impedire la riproduzione, e lasciati sviluppare fino allo stadio adulto.

A partire da questo momento, i vermi adulti vengono osservati ogni due o tre giorni fino a quando tutti i vermi non sono morti. A ogni punto temporale, i vermi morti vengono rimossi dalla piastra e viene registrato il numero di vermi vivi e morti. Sono George Seton del laboratorio di Matt Capline del Dipartimento di Patologia dell'Università di Washington.

Oggi vi mostreremo come misurare la durata della vita e osservare la nostra eleganza epatica. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la genetica dell'invecchiamento. Cominciamo dunque.

Un esperimento di base sulla durata della vita richiede due tipi di piastre: piastre NGM standard, che non contengono additivi, e piastre AMP FUDR, alle quali vengono aggiunti ampicillina e fluorodesossiuridina nel mezzo NGM. Entrambi i tipi di piastre vengono seminati con batteri e coli OP 50, che successivamente vengono inattivati mediante esposizione ai raggi UV. Iniziare preparando 10 millilitri di soluzione NGM.

Per un piatto di Petri da 60 millimetri, sciogliere completamente il terreno NGM solido irradiandolo a microonde alla massima potenza con impulsi di 32 secondi. Agitare il terreno tra un impulso e l'altro per evitare l'accumulo di bolle di gas pressurizzato; quindi versare il terreno liquido in un bagno termico a 55 gradi Celsius oppure lasciarlo in banco per farlo raffreddare. Una volta che il terreno ha raggiunto i 55 gradi Celsius, temperatura alla quale si dovrebbe riuscire a tenere comodamente il contenitore di vetro a mani nude, è pronto per l'aggiunta di farmaci.

E per versare le piastre contenenti farmaci, aggiungere 33 microlitri di FUDR 150 millimolare e 100 microlitri di ampicillina 100 milligrammi per millilitro per ogni 100 millilitri di NGM, quindi agitare delicatamente per mescolare. L'ampicillina viene utilizzata per prevenire contaminazioni batteriche indesiderate, mentre il FUDR impedisce alle uova di schiudersi, in modo che i vermi non debbano essere trasferiti ogni pochi giorni per separarli dalle larve in crescita.

Ora versare il mezzo e lasciare asciugare le piastre sul banco per due giorni. Il giorno prima del completamento dell'essiccazione delle piastre, preparare una coltura liquida di LB seminando un singolo colonia proveniente da una striatura fresca di e coli. Batteri OP 50 su agar LB. Preparare almeno 0,5 millilitri di coltura per ogni piastra da 60 millimetri.

Collocare la coltura OP 50 in un agitatore a 37 gradi Celsius e lasciare crescere i batteri per tutta la notte. Il giorno successivo, pellettizzare i batteri OP 50 con una forza centrifuga di 3.500 ×g per 10 minuti. Decantare una quantità sufficiente del soprannatante per risospendere i batteri a una concentrazione 10×.

Ora inoculare ogni piastra con 100 microlitri della coltura concentrata. Evitare di toccare la superficie dell'NGM con la punta della pipetta, poiché imperfezioni nella superficie del terreno potrebbero permettere ai vermi di scavare. Ruotare le piastre fino a quando i batteri coprono l'area centrale dell'NGM senza avvicinarsi ai bordi della piastra e lasciare le piastre ad asciugare sul banco per 24 ore. Una volta asciutte, esporre la superficie delle piastre a una dose di UV sufficientemente intensa da bloccare la crescita batterica; utilizziamo un crosslinker UV Strata Gene 2400.

Iniziare caricando le piastre nel collegamento a cavalcioni senza i coperchi. Ora premere energia. Inserire 9 9 9 9 sul tastierino numerico e premere avvio.

Le piastre saranno esposte ai raggi UV per circa cinque minuti. Le piastre con batteri uccisi dai raggi UV possono essere conservate capovolte a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese. Questa sezione descrive come generare una popolazione di vermi con una data di schiusa comune.

Trasferire innanzitutto circa 20 vermi adulti giovani in una piastra NGM fresca senza farmaci. Lasciare la piastra a 25 gradi Celsius per circa una settimana, in modo da permettere ai vermi di riprodursi e consumare tutto il cibo batterico entro una settimana. I vermi appena schiusi, nel loro stadio larvale di arresto della crescita, dovrebbero apparire; trasferire da 20 a 30 larve in stadio dauer in una piastra NGM fresca senza farmaci e incubarle a 25 gradi Celsius in presenza di cibo.

I larvi dower diventeranno adulti riproduttivamente attivi entro due giorni e rimarranno riproduttivamente attivi per alcuni giorni successivi. Trasferire ora da 10 a 15 adulti riproduttivamente attivi su una piastra NGM fresca senza farmaci. Questa piastra è indicata come piastra di deposizione delle uova temporizzata o TEL.

Lasciare la piastra TEL a 25 gradi Celsius affinché i vermi depongano le uova. Gli animali che schiuderanno da queste uova saranno gli animali sperimentali e la loro longevità verrà valutata dopo sei ore. Ispezionare la piastra TEL alla ricerca di uova.

Se non ci sono ancora abbastanza uova, lasciare la piastra TEL a 25 gradi Celsius per un massimo totale di 24 ore, controllando periodicamente la presenza di uova. Quando è stato deposto un numero sufficiente di uova, rimuovere gli adulti dalla piastra TEL.

Un esperimento tipico sulla durata della vita richiederà da 30 a 90 uova per ogni gruppo sperimentale, ma diverse centinaia di uova possono essere prodotte su una singola piastra TEL. Circa 150 uova vengono deposte da 10 a 15 adulti riproduttivamente attivi nell'arco di sei-otto ore. Confrontando i gruppi sperimentali, è possibile ottenere significatività statistica per differenze ampie nella durata della vita anche con soli 30 animali.

È necessario utilizzare un numero maggiore di animali per distinguere differenze più modeste. Posizionare ora la piastra TEL senza adulti a 20 gradi Celsius fino a quando le uova si schiudono e i vermi raggiungono lo stadio larvale L4. Ciò richiede in genere due giorni per il ceppo selvatico di C. elegans, ma può richiedere più tempo per ceppi con fenotipi di sviluppo lento.

Questa sezione descrive come seguire lo sviluppo di una popolazione sincronizzata per età. Trasferire innanzitutto le larve L4 dalla piastra TEL a piastre AMP FUDR. Per ogni ceppo o condizione in esame, è consuetudine preparare due o tre piastre con 25-30 vermi per piastra.

Incubare le piastre AMP FUDR a 20 gradi Celsius per 24 ore. Successivamente, valutare visivamente i vermi, il mezzo e i batteri, quindi trasferire i vermi su piastre AMP FUDR fresche. Se i vermi hanno consumato la maggior parte del cibo batterico, questa operazione avverrà tipicamente una o due volte alla settimana.

All'inizio dell'esperimento, se è presente un numero significativo di larve, ciò indica solitamente che i vermi sono stati trasferiti sulle piastre con AMP e FUDR come adulti giovani anziché come L4. Gli adulti giovani possono deporre uova prima che il FUDR faccia effetto, e occasionalmente alcune larve sfuggono all'azione del FUDR e si sviluppano in adulti. Queste larve altererebbero l'esperimento; in tal caso, trasferire i vermi adulti su piastre fresche e scartare le vecchie piastre contenenti le larve.

I vermi devono essere trasferiti anche su piastre fresche se si osservano batteri vivi in crescita. Generalmente, la combinazione di AMP e uccisione mediante UV garantisce che nessun batterio vivo contamini l'esperimento, ma occasionalmente ciò può accadere. Inoltre, trasferire i vermi.

Se si osserva crescita fungina sul mezzo. Se individuata abbastanza precocemente, la muffa può essere rimossa utilizzando la punta di una pipetta o una spatola. Una volta che il fungo raggiunge un diametro superiore a qualche millimetro, di solito è più semplice trasferire i vermi in una nuova piastra.

Valutare la longevità di tutti i vermi ogni due o tre giorni. Utilizzando un microscopio stereoscopico, determinare se ciascun verme è vivo o morto.

Battere leggermente sul piatto. Il verme è vivo se si muove in risposta al battito. Se il verme non risponde battendo sul piatto, ingrandire la regione della testa e battere delicatamente sulla testa del verme con un'asticella di platino.

Valutare il verme come morto. Se non risponde muovendo la testa, rimuovere il verme morto dalla piastra. Dopo aver controllato tutti i vermi, registrare la data e il numero di vermi vivi e morti.

I vermi allevati su mezzi solidi a volte possono uscire dalla superficie della piastra scavando o strisciando lungo la parete. I vermi fuggiti vengono completamente esclusi dallo studio. Al termine, riposizionare le piastre nell'incubatrice a 20 gradi Celsius.

Attendere altri due o tre giorni, quindi controllare nuovamente le piastre. Continuare questo regime fino a quando tutti i vermi non saranno morti. Il numero di vermi che muoiono ogni giorno viene solitamente invertito per calcolare la proporzione di vermi vivi ogni giorno; questi dati vengono rappresentati graficamente come una curva di sopravvivenza, considerando il giorno della deposizione delle uova come punto temporale di riferimento.

Giorno zero. La vita media tipica per N two. Il ceppo selvatico di Sea elgan mantenuto su batteri uccisi con raggi UV a 20 gradi Celsius è di circa 25 giorni, misurata a partire dall'uovo.

Abbiamo appena mostrato come misurare la durata della vita e osservare l'eleganza. È possibile modificare questa procedura di base per testare diverse condizioni ambientali, inclusa la restrizione dietetica e l'interferenza dell'RNA, argomenti trattati nel testo supplementare. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.