Focale Ca ^{2 +} Rilevamento transitoria nel muscolo liscio

Prima di tutto, si prepara una soluzione di carico del calcio, che viene riscaldata e gassata. La vescica urinaria viene dissezionata, aperta, fissata in posizione piatta e da essa si preleva una striscia di detrusore. La striscia di detrusore viene aggiunta alla soluzione di carico, incubata e risciacquata, quindi fissata in posizione piatta.

Il calcio nel quarto strato del tessuto viene eccitato da una luce laser e viene catturata la luce emessa in seguito. I filmati, composti da singole immagini, vengono analizzati confrontando frame successivi. Lo sfondo viene sottratto.

La soglia del bordo cellulare determina dove possono essere individuati gli eventi e viene calcolato un rapporto tra cervelli successivi. Se gli eventi rimanenti corrispondono a criteri predefiniti, vengono evidenziati e contrassegnati. Ciao, mi chiamo John Young dei laboratori di Keith Brain e Tom Kinane presso il Dipartimento di Farmacologia dell'Università di Oxford.

Sono Rob Amos, anch'io dei laboratori Brain e Canne, e il mio nome è Keith Brain. Oggi John e Rob vi mostreranno una tecnica di imaging del calcio nel muscolo liscio. Utilizziamo questa tecnica nel nostro laboratorio per studiare il rilascio di neurotrasmettitori dai nervi autonomi e il loro effetto sul muscolo liscio.

Iniziamo. L'indicatore del calcio organ green, 4 88 BAFTA 1:00 AM, è disponibile in fiale da 500 microlitri contenenti 50 microgrammi di polvere. Per preparare l'indicatore del calcio, aggiungere 40 microlitri di soluzione Onic F1 27 alla polvere e agitare delicatamente per 30 secondi; successivamente, aggiungere 460 microlitri di soluzione salina fisiologica (PSS) e agitare delicatamente per altri 30 secondi.

La soluzione finale, 10 micro molari di organ green. 4 88 BAFTA 1:00 AM fornisce quattro aliquote da 125 microlitri ciascuna. Evitare l'esposizione alla luce e conservare la soluzione a meno 20 gradi Celsius prima di dissezionare il tessuto di interesse.

Rimuovere l'indicatore del calcio dal congelatore e farlo scongelare a temperatura ambiente mentre l'indicatore del calcio è sottile. Versare un millilitro di PSS in un tubo da prova e immergerlo in un bagno d'acqua a 33 gradi Celsius. Fissare un diffusore di gas nel tubo da prova mediante un tappo di gomma, oppure si può utilizzare il perfil, quindi spurgare con una miscela di 95%ossigeno e 5%anidride carbonica a una velocità di circa una bolla al secondo.

Dissezionare l'organo del muscolo liscio dall'animale. In questo caso, si tratta della vescica urinaria di un topo. Posizionare l'organo in circa 50 millimetri di PSS per lavarlo; dopo aver accuratamente lavato il tessuto, rimuovere il tessuto adiposo e il tessuto connettivo.

Dissezionare secondo il tipo di muscolo liscio laurean per la vescica urinaria. Aprire longitudinalmente dal collo della vescica, dall'estremità coddle fino alla sommità della cupola. All'estremità cranica preparare quattro strisce lunghe sei-otto millimetri e larghe uno-due millimetri lungo la superficie dorsale del resser, tagliando nella direzione dei fasci muscolari predominanti.

Posizionare il tessuto dissezionato e la PSS preriscaldata e gassata in un tubo da saggio, aggiungendo 125 microlitri di organ green 10 micromolare, 4 88 B alle 01:00, quindi agitare leggermente a mano per mescolare. Reintrodurre il tubo nel bagnomaria. Riprendere la gassatura e coprire il bagnomaria con un foglio di alluminio.

Il tempo necessario affinché un quantitativo sufficiente di tessuto incorpori l'indicatore del calcio varia in base alle dimensioni del tessuto e allo spessore dello strato muscolare liscio. Ad esempio, per il detrusore del topo e gli oxs del ratto, il tempo è di 70 minuti. Per il detrusore del ratto e le VAs deens del topo, invece, l'incubazione dura 120 minuti.

Dopo aver caricato il tessuto con l'indicatore del calcio, è possibile procedere con la preparazione per la microscopia. In primo luogo, risciacquare il tessuto in PSS aerato per 10 minuti. Successivamente, montare il tessuto in una piastra di preparazione foderata con una griglia S.

Stirarla leggermente per formare un foglio piatto. Fissare il tessuto utilizzando spezzoni corti, ad esempio due millimetri di filo di argento con diametro compreso tra 25 e 50 micrometri, inserendo i perni con un angolo.

Evitare l'uso di perni più lunghi di alcuni millimetri poiché potrebbero graffiare l'obiettivo. Un fissaggio accurato del tessuto è importante per ridurre al minimo gli spostamenti spontanei del tessuto e per facilitare l'individuazione di un sito adatto all'acquisizione di immagini. Dopo aver fissato il tessuto, posizionare la preparazione sul piatto del microscopio.

Attenzione a non far fuoriuscire il PSS dalla zona del piatto rivestita con sil guard. Ciò potrebbe portare a un'estesa copertura del piatto da parte del PSS. Quando inizierà la sovrafusione a scopo dimostrativo, i seguenti passaggi verranno eseguiti alla luce.

Si noti che questi esperimenti vengono normalmente eseguiti al buio. Accendere la pompa per superfusionare il preparato. Con PSS, si utilizza spesso una portata di 100 millilitri all'ora.

Accendere l'unità di riscaldamento, posizionare i tubi di ingresso e di uscita e la sonda termica sulla piastra di preparazione fissandoli alla striscia metallica mediante il magnete alla base. L'altezza della punta del tubo di uscita determinerà la profondità della PSS. Prestare attenzione per assicurarsi che il flusso in uscita stia effettivamente rimuovendo la PSS, poiché a volte potrebbe non farlo.

Impostare inizialmente la temperatura dell'unità di riscaldamento per raggiungere la temperatura desiderata compresa tra 33 e 35 gradi Celsius. Lasciare che il tessuto raggiunga l'equilibrio per almeno 10 minuti utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento. 10 o 20 volte.

Utilizzare la fluorescenza epi o l'eccitazione con luce blu per visualizzare il muscolo liscio e identificare una regione adatta da monitorare. Poiché l'esposizione all'illuminazione di eccitazione provoca il fotoblecemento dell'indicatore, evitare di utilizzarla per più di pochi secondi alla volta.

Evitare aree con strutture luminose poiché potrebbero causare un elevato numero di falsi positivi nell'algoritmo di rilevamento delle immagini. Provare a scegliere un sito con movimenti minimi e un elevato numero di cellule muscolari lisce nel campo visivo. Una volta selezionata l'area da acquisire, passare a un obiettivo con maggiore ingrandimento, ad esempio 40 x.

Ruotare la piastra o l'asse ottico in modo che la cellula o le cellule muscolari lisce siano orizzontali, ovvero parallele all'asse di scansione rapida. Le cellule muscolari lisce sono ora pronte per l'acquisizione mediante microscopia confocale.

In questo protocollo, utilizziamo un microscopio confocale verticale Leica SP due. Chiudere il diaframma fino a raggiungere un disco di Airy. Impostare la potenza del laser tra il 25 e il 35% sul filtro ottico regolabile personalizzato.

Questo valore rappresenta un compromesso tra luminosità e fotodegradazione. Per prepararsi all'analisi dei dati, scaricare e installare ImageJ. Scaricare la versione specifica per la piattaforma e quindi aggiornarla all'ultima versione scaricando l'ultimo file jar di ImageJ per sostituire il file precedente. Successivamente, scaricare il file jar di Excel Writer e installarlo nella directory dei plugin jar.

Copiare questi file nella directory dei plugin. Installare ciascuno di questi script utilizzando le macro dei plugin. Installare la funzione di ImageJ. Il software per il microscopio confocale Leica SP due che utilizziamo si chiama Leica.

LCS salva singoli fotogrammi di ogni serie come file separati. Per ricostruire la serie, assicurarsi che tutti i fotogrammi da ricostruire siano in una singola cartella.

Ad esempio, la cartella dati tiffs. Quindi selezionare la macro Leica SP two stacker dal menu plugin macros. Selezionare la directory principale, in questo caso la cartella dati.

Selezionare la cartella desiderata dall'elenco a discesa. In questo caso, tiffs selezionare una directory di output o crearne una nuova. Ad esempio, cartella dati stacks.

Lo script ricostruirà quindi la serie a partire dai singoli fotogrammi per correggere i movimenti. Utilizziamo un algoritmo disponibile gratuitamente che allinea o confronta i fotogrammi all'interno di un pacchetto di serie scaricato, rig e turbo reg. Copiare i file per ciascuno nella cartella stacks.

Caricare uno stack da elaborare, quindi passare a un fotogramma che mostri chiaramente il campo di interesse. Tutti gli altri fotogrammi verranno allineati a questo fotogramma di riferimento. Successivamente, andare su plugin stack.

Prova ciascuna delle diverse trasformazioni per determinare quale sia la più efficace per ciascun sito. I fattori immagine che influenzano il rilevamento dei transitori di calcio varieranno in base alla misurazione di determinate proprietà e ai parametri delle particelle di ciascun sito.

La sensibilità e la specificità della rilevazione aumentano. Pertanto, per ogni sito calcoleremo la soglia sottratta alla soglia del rapporto e la soglia del bordo cellulare. Per iniziare, andare su plugin, macro, installa e seleziona jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Quindi andare su plugin macro carica stack.

Selezionare una serie e calcolare i seguenti parametri delle particelle. Per calcolare la soglia per la sottrazione, selezionare una regione rettangolare di interesse su quella che si ritiene essere l'area di fondo da misurare. Prendere nota della media. Per calcolare la soglia del rapporto, selezionare una regione rettangolare di interesse intorno a un'area otticamente piatta della cellula o delle cellule muscolari lisce.

Misurare la nota media e la deviazione standard. Ripetere il processo altre due volte, oppure è possibile disegnare tre riquadri contemporaneamente premendo Maiusc. Calcolare e annotare la soglia per il rapporto.

Calcolare come la deviazione standard divisa per la media, aggiungere uno e quindi moltiplicare il risultato per 32. Mediando i valori delle tre repliche, il fattore 32 è necessario per tenere conto dell'algoritmo di rapporto, in cui nessuna variazione rispetto al fotogramma precedente viene mappata su un valore intero pari a 32. Ciò fornisce un'adeguata gamma dinamica per rilevare aumenti e diminuzioni del rapporto.

Per un'immagine a otto bit, selezionare l'opzione "adjust threshold" nell'immagine. Scegliere nero e bianco. Definire al di sotto del limite superiore della slide e annotare il valore corrispondente.

Questo si trova a destra del cursore. Verranno conteggiati solo gli eventi che si verificano nelle regioni nere. Fare clic su ripristina.

Ora che sono stati calcolati i valori soglia per il rapporto e per il bordo della cellula, possiamo analizzare gli stack di immagini. Determinare la posizione degli stack da analizzare. A questo stadio, selezionare una sola serie.

Questo è il primo file e l'ultimo file deve essere lo stesso. Quindi selezionare una posizione per l'output dei file di dati e degli stack. Ad esempio, la cartella di output dei dati.

Inserire i valori della soglia per sottrarre la soglia del rapporto e la soglia del bordo della cellula. Lasciare le altre impostazioni ai valori predefiniti. L'algoritmo produrrà una finestra a due riquadri in cui la serie elaborata viene mostrata a sinistra e l'originale a destra.

Aprire questo file dalla cartella di output ed esaminarlo attentamente per valutare il numero di falsi positivi e i casi in cui eventi visibili ad occhio nudo non sono stati rilevati. Per ogni serie, l'algoritmo genera un file Excel che riporta le caratteristiche degli eventi rilevati, come ampiezza, area e posizione; i falsi positivi identificati esaminando i file immagine prodotti dall'algoritmo possono essere rimossi manualmente da questo file Excel, anche se si dovrebbero adottare criteri rigorosi per farlo.

Questo è un filmato del transitorio del calcio nel muscolo liscio. In questo esempio, il filmato è composto da 100 singole immagini acquisite a cinque hertz. Acquisiremmo molti di questi filmati per ogni esperimento durante lo studio, ad esempio, dell'effetto di un particolare farmaco sulla frequenza del transitorio del calcio.

Qui osserviamo numerosi transitori spontanei del calcio nelle cellule muscolari lisce. Qui viene mostrato il risultato dell'algoritmo di rilevamento delle particelle. Per ogni serie, l'algoritmo produce un file Excel che dettaglia le caratteristiche dell'evento rilevato, come ampiezza, area e posizione.

Abbiamo quindi dimostrato un metodo per l'acquisizione di immagini dei transitori del calcio in organi muscolari lisci come la vescica urinaria, e abbiamo illustrato un approccio per analizzare tali transitori del calcio mediante un algoritmo sviluppato in laboratorio. È fondamentale ricordare di preparare adeguatamente il tessuto per l'acquisizione delle immagini del calcio. Nel caso del tessuto mostrato oggi, ciò consiste nel rimuovere il tessuto connettivo e qualsiasi accumulo adiposo che potrebbe ostacolare il campo visivo.

È inoltre importante fissare il tessuto in un foglio piatto. Bene, buona fortuna con i vostri esperimenti e grazie per averci seguito.