La preparazione standardizzata di Single-Cell Sospensioni da tessuto polmonare del mouse utilizzando il dissociatore gentleMACS
2 luglio 2009
Dissociare cellule di tipi di tessuto specifico richiede parametri specifici per l'agitazione dei tessuti per ottenere un elevato volume di vitali, cellule coltivabili. Il Miltenyi gentleMACS dissociatore ottimizza questa operazione con un semplice protocollo pratico. In questa pubblicazione l'utilizzo di questo apparecchio sul tessuto polmonare viene spiegata.
In questo protocollo video, vedrai come dissociare il tessuto polmonare di topo adulto utilizzando gentle max dopo la dissociazione del tessuto polmonare. In presenza di collagenasi D e DNAsi, le sospensioni cellulari vengono filtrate mediante un filtro cellulare da 70 micron e una centrifuga, quindi sospese per ulteriori applicazioni. Ciao, sono Melanie Mlu di Mil Biotech in Germania.
Oggi vi mostrerò un procedimento riproducibile e automatizzato per la preparazione di una sospensione di singole cellule a partire da tessuto polmonare di topo, utilizzando la dissociazione GenX. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per preparare sospensioni di singole cellule destinate all'isolamento di leucociti o cellule endoteliali. Bene, cominciamo.
Prima di iniziare il protocollo, è necessario preparare alcune soluzioni standard e tenerle pronte. In primo luogo, avremo bisogno del buffer di Hebes. In secondo luogo, una soluzione di collagenasi D contenente 100 milligrammi per millilitro di enzima e buffer di Hebes.
Terzo, una soluzione di dase one contenente 20.000 unità per millilitro di dase one. Infine, due comuni soluzioni tampone. Un tipico tampone PBS a pH 7,2 e un tampone PEB derivato dalla soluzione di risciacquo AutoMax e dalla soluzione stock di BSA.
Iniziamo il nostro protocollo con un polmone dissezionato ottenuto da un topo femmina da biopsia di età compresa tra sei e sette settimane. Assicurarsi che il polmone sia privo di organi adiacenti come cuore e timo, vasi sanguigni efferenti e afferenti, trachea e tessuti connettivi. Sciacquare il tessuto in una piastra di Petri contenente PBS per rimuovere gli eritrociti.
Tipicamente, un polmone di topo a quest'età pesa tra 110 e 150 milligrammi. Se si prevede di associare polmoni provenienti da animali più vecchi o da altre linee di topo, pesare il tessuto e il buffer. Un massimo di 450 milligrammi di tessuto può essere dissociato per ogni tubo.
Trasferire il tessuto polmonare in una provetta gentle max C contenente 4,9 millilitri di buffer heis. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di collagenasi D per ottenere una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro nel tessuto polmonare e nel buffer. Ora 10 microlitri di dase.
Una soluzione per più di 150 milligrammi di tessuto. Aggiungere 20 microlitri di soluzione enzimatica uno. Assicurarsi che il tubo C sia ben chiuso e posizionarlo capovolto sul gentle max dis.
Assicurarsi che il tessuto si trovi tra il rotore e lo statore. Selezionare il programma per il polmone ed eseguirlo premendo il pulsante di avvio; al termine del programma, rimuovere il tubo C dall'apparecchio e incubare il campione per 30 minuti.
In un incubatore a 37 gradi Celsius durante l'incubazione, il tubo deve essere ruotato utilizzando il rotatore per tubi max mix o girato manualmente ogni cinque minuti. Al termine dell'incubazione, riposizionare il tubo C nell'agitatore delicato max Associator ed eseguire il secondo programma polmonare. Mentre il programma è in esecuzione, preparare un tubo da 50 millilitri per raccogliere le cellule filtrate sostituendo il tappo con un filtro cellulare in maglia da 70 micrometri. Una volta terminato il programma di dissociazione, a seconda della distribuzione del materiale campione nel tubo, si potrà centrifugare brevemente il tubo per concentrare il materiale campione.
Le cellule dissociate possono essere prelevate dal tubo mediante pipettaggio attraverso il tappo sigillato con settimo del tubo C. Utilizzando una punta da pipetta adatta da 1000 microlitri, la sospensione cellulare viene applicata sul filtro cellulare per rimuovere particelle più grandi o aggregati. Una volta che la soluzione è drenata, lavare il filtro cellulare aggiungendo ulteriori cinque millilitri di tampone hees a temperatura ambiente per formare il pellet delle cellule filtrate.
Centrifugare il tubo da 50 millilitri a 300 ×g per 10 minuti. Aspirare ora il soprannatante e risospendere il pellet cellulare nel volume desiderato di tampone PEB a temperatura ambiente.
Non travasare il soprannatante. È ora possibile procedere con l'applicazione successiva. La dissociazione del tessuto polmonare di topo mediante questo procedimento consentirà di ottenere una percentuale elevata di leucociti e cellule endoteliali vitali.
Le sospensioni cellulari singole ottenute sono state marcate con CD45 PE, CD146 FITC o CD31 FITC, e analizzate mediante citometria a flusso. Questo grafico mostra l'arricchimento delle cellule dendritiche utilizzando microperle CD11c, un separatore minimax e due colonne MS. Ho appena mostrato come preparare sospensioni cellulari singole a partire da tessuto polmonare murino in modo standardizzato, utilizzando la dissociazione con GentleMACS e provette C.
Questo metodo permette la dissociazione efficiente del tessuto gen. Durante questa procedura, è importante dissezionare correttamente il polmone ed elaborare immediatamente il tessuto dopo la dissezione. Le sospensioni cellulari singole così ottenute possono quindi essere utilizzate per ulteriori esperimenti.
Ad esempio, l'etichettatura magnetica delle cellule e successivamente la separazione dei leucociti o delle cellule endoteliali. Bene, è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo protocollo video illustra la dissociazione del tessuto polmonare di topo adulto mediante il dissociazione gentileMACS. La procedura è stata progettata per produrre un elevato numero di cellule vitali e coltivabili per ulteriori applicazioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Tecniche di dissociazione cellulare
- Preparazione di sospensioni di singole cellule
- Analisi del tessuto polmonare murino
Sfondo
- La dissociazione delle cellule dai tessuti richiede parametri specifici.
- Il dissociatore gentleMACS fornisce un protocollo ottimizzato.
- Collagenasi D e DNasi vengono utilizzate nel processo di dissociazione.
- Le sospensioni cellulari filtrate sono preparate per ulteriori applicazioni.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo riproducibile per la preparazione di sospensioni di singole cellule.
- Facilitare lo studio dei leucociti e delle cellule endoteliali.
- Fornire un protocollo pratico per i ricercatori del settore.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo del dissociatore gentleMACS per l'agitazione del tessuto.
- Applicazione di collagenasi D e DNasi durante la dissociazione.
- Filtrazione delle sospensioni cellulari attraverso un filtro cellulare da 70 micron.
- Centrifugazione e sospensione delle cellule per ulteriori applicazioni.
Risultati principali
- Dissociazione riuscita del tessuto polmonare murino in sospensioni cellulari singole.
- Elevato numero di cellule vitali e coltivabili ottenute.
- Il protocollo ha dimostrato riproducibilità ed efficienza.
- Il campione è adatto per applicazioni successive.
Conclusioni
- Il dissociazione gentleMACS è efficace per la dissociazione del tessuto polmonare.
- Questo metodo può essere applicato a diversi tipi di tessuto.
- Fornisce uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano il tessuto polmonare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La dissociazione standardizzata dei tessuti è un passaggio critico preliminare nella ricerca in immunologia e biologia vascolare, che permette la preparazione riproducibile di sospensioni cellulari primarie per analisi successive. Il Dissociatore gentleMACS fornisce un metodo automatizzato, delicato e scalabile per generare sospensioni di singole cellule con elevata vitalità a partire da tessuto polmonare murino, garantendo un input costante per la citometria a flusso, il sorting cellulare e il profilo molecolare. Questa capacità aumenta l'affidabilità predittiva negli studi di validazione degli target riducendo la variabilità nel rendimento cellulare e nella vitalità tra esperimenti diversi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle popolazioni di leucociti e cellule endoteliali nel tessuto polmonare per la verifica di ipotesi mirate.
- Valore operativo: Riduce la variabilità manuale nella lavorazione dei tessuti, migliorando la riproducibilità tra laboratori e punti temporali.
- Valore predittivo: Favorisce un apporto cellulare costante per la citometria a flusso e il sorting, aumentando l'affidabilità dei risultati dello screening fenotipico.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce sospensioni filtrate e prive di detriti, adatte alla colorazione con anticorpi e a saggi basati su flusso.
- Valore operativo: La digestione enzimatica standardizzata e la dissociazione meccanica garantiscono coerenza tra i diversi lotti in termini di resa cellulare.
- Prontezza per i saggi: Genera sospensioni compatibili con applicazioni successive come l'etichettatura magnetica e la separazione cellulare.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Fornisce un sistema rilevante per lo studio della dinamica delle cellule immunitarie e vascolari nel tessuto polmonare in condizioni di malattia.
- Supporto al Modello Preclinico: Permette l'isolamento di cellule primarie dai polmoni di topo per l'analisi meccanicistica e la riduzione del rischio dei bersagli terapeutici.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Una preparazione affidabile delle cellule supporta analisi biomolecolari e validazioni funzionali coerenti nei flussi di lavoro preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il Dissociatore gentleMACS si inserisce nel flusso di lavoro di scoperta come passaggio standardizzato di preparazione del campione tra il prelievo del tessuto e l'analisi cellulare, consentendo una transizione affidabile da tessuto ex vivo a singole cellule pronte per il saggio.
- Biologia della scoperta: Supporta l'isolamento guidato da ipotesi di cellule immunitarie e stromali residenti nel polmone per l'analisi di percorsi molecolari.
- Screening: Fornisce sospensioni cellulari riproducibili per lo screening fenotipico ad alto contenuto o basato su citometria a flusso di modulatori immunitari.
- Analisi: Permette letture quantitative mediante citometria a flusso (ad esempio, CD45+, CD31+) per confrontare condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega modelli murini del polmone a studi su cellule immunitarie e endoteliali rilevanti per l'uomo attraverso una preparazione standardizzata.
- Riutilizzo aziendale: Il protocollo pre-programmato per il polmone presente nello strumento consente il riutilizzo in diversi progetti che studiano infiammazione polmonare, fibrosi o infezioni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Un'elevata vitalità e purezza di leucociti e cellule endoteliali aumentano la qualità dei dati nelle applicazioni successive.
- Valore operativo: L'automazione riduce il tempo di manipolazione manuale e la variabilità dipendente dall'operatore nella dissociazione del tessuto.
- Valore strategico: Permette decisioni di avanzamento o interruzione basate su rese cellulari e parametri di vitalità costanti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei bersagli in base al rischio fornendo input affidabili di cellule primarie per la validazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede una formazione nella dissezione asettica dei tessuti e nella manipolazione enzimatica.
- Richiede l'accesso a un Dissociatore gentleMACS con programma specifico per il polmone e tubi C.
- Necessita della standardizzazione delle concentrazioni enzimatiche (Collagenasi D, DNasi) e delle condizioni del buffer tra diversi utilizzatori.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse ceppi di topi, età o modelli di malattia che influenzano la densità del tessuto.
- Limitato ai tessuti compatibili con la dissociazione enzimatica; potrebbero essere necessarie alternative meccaniche per campioni fibrosi o calcificati.
