Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale
15 settembre 2009
Questo protocollo descrive l'uso di microiniezione e di imaging ad alta risoluzione nel Drosophila melanogaster Embrione sinciziale per studiare la mitosi.
Questa procedura inizia con il prelievo di embrioni da piastre con succo di uva fresco per un periodo di 30-60 minuti. Dopo aver rimosso la piastra dalla gabbia del lago, raccogliere gli embrioni con un pennello inumidito e posizionarli su nastro adesivo doppio. Rotolare delicatamente un embrione sul nastro utilizzando una delle due estremità di una pinzetta finché il corione non si apre.
Prelevare l'embrione e posizionarlo delicatamente sul coperchio. Ricoprirlo con uno strato di colla het. Ripetere l'operazione fino ad ottenere un numero sufficiente di embrioni.
Dopo la disidratazione, gli embrioni sono pronti per l'iniezione. Salve, sono Ingrid Bruce Musher del laboratorio del Dottor Jonathan Sculley del Dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare dell'Università della California di Davis. Oggi vi mostreremo una procedura per microiniettare embrioni sinciziali di Drosophila.
Utilizziamo questa procedura per studiare il ruolo dei microtubi e dei motori basati sulla miosina nella mitosi. Ad esempio, iniettiamo microscopicamente anticorpi o altri inibitori di proteine mitotiche specifiche. Analizzando l'effetto dell'inibitore sulla mitosi, siamo in grado di determinare la funzione della proteina bersaglio.
Iniziamo. Per iniziare i preparativi due o tre giorni prima dell'esperimento, preparare la gabbia di deposizione tagliando due piccoli fori di circa un centimetro quadrato su lati opposti di una bottiglia di plastica. Riempire i fori con un pezzo di cotone, in modo da permettere il passaggio dell'aria.
Trasferire le mosche nel flacone e quindi coprirlo con una piastra contenente succo d'uva. In presenza di lievito, mantenere la gabbia per le zampe a temperatura ambiente: le mosche deporranno uova per un periodo di almeno 10 giorni, da effettuare almeno un giorno prima dell'esperimento. Prelevare gli aghi per iniezione e conservarli a quattro gradi Celsius.
Nel giorno dell'esperimento, preparare e caricare gli aghi. In primo luogo, prelevare la tubulina etichettata dal congelatore e metterla sul ghiaccio per cinque-quindici minuti. Successivamente, diluirla con buffer GPEM e quindi centrifugarla per 10-15 minuti a 13.000 giri al minuto a quattro gradi Celsius.
Infine, caricate uno o due microlitri nell'ago e manteneteli a quattro gradi Celsius, per prevenire la polimerizzazione indotta dalla temperatura nell'ago. Prima di predisporre il vetrino coprioggetto, preparate una colla a base di eptano arrotolando del nastro adesivo doppio e collocandolo in una bottiglia da 100 millilitri.
Aggiungere circa 50 millilitri di eptano, sigillare la bottiglia e agitarla per diversi giorni. Prima di preparare gli embrioni, realizzare una camera di disidratazione in cui verranno posti gli embrioni prima dell'iniezione. Per fare ciò, inserire una parte di una piastra da 35 millimetri all'interno di una capsula di Petri da 100 millimetri per creare un supporto, quindi aggiungere essiccante, apposito, costituito da solfato di calcio anidro intorno al supporto, in modo che l'altezza dell'essiccante non superi quella del supporto, e coprire.
Per iniziare la preparazione degli embrioni, raccoglierli prima dalla gabbia lacustre sostituendo ogni ora la piastra con succo d'uva e lievito; gli embrioni devono essere osservati al microscopio circa due ore dopo l'inizio della raccolta. Per preparare il vetrino coprioggetto, posizionarlo su un lato del vetrino del microscopio e fissare con del nastro adesivo i quattro angoli in modo che non si muova. Utilizzando un applicatore con estremità di cotone, depositare un unico strato di colla al heptano in una linea sul coprioggetto.
La colla non deve essere viscosa e deve asciugarsi in pochi secondi. Se è troppo densa, aggiungere altro eptano. Infine, applicare un pezzo di nastro adesivo doppio su un lato del vetrino accanto al coprioggetto.
Fai scivolare con un pennello inumidito. Preleva con attenzione gli embrioni dalla piastra di succo d'uva e posizionali sul nastro adesivo doppio sul vetrino. Successivamente, utilizza una delle due estremità di una pinzetta per rotolare gli embrioni sul nastro adesivo doppio fino a quando il corione si apre.
Prendere l'embrione arrotolandolo delicatamente sul Corian in modo che aderisca alla pinzetta e posizionarlo sulla colla di eptano presente sul vetrino. Disporlo con il lato lungo dell'embrione parallelo al lato lungo del vetrino. Posizionare da 10 a 20 embrioni in una singola fila.
Rimuovere il vetrino e posizionarlo nella camera di disidratazione per tre a otto minuti. Il tempo dipende dall'umidità locale e dalla quantità da iniettare. Successivamente, posizionare il vetrino su una camera metallica con grasso da vuoto.
Infine, coprire gli embrioni con olio al carbonio alogeno per evitare ulteriore disidratazione. Gli embrioni sono ora pronti per l'iniezione. Per prima cosa, individuare gli embrioni utilizzando un obiettivo 16x.
Spostare gli embrioni e individuare l'ago senza modificare il piano focale. Centrare l'ago e spostarlo verso l'alto senza muoverlo nelle direzioni X o Y. Per aprire l'ago, posizionare il bordo del vetrino nel campo visivo, ma non nel punto in cui si troverà l'ago.
Abbassi l'ago fino al medesimo piano focale. Sposti con molta attenzione il vetrino coprioggetto finché non tocca l'ago e lo rompe delicatamente. Sollevi l'ago.
Ora portare gli embrioni in vista. Abbassare l'ago nell'olio e assicurarsi di ottenere gocce di liquido regolari dall'ago. Spostare con movimento costante l'embrione verso l'ago, iniettare una goccia nell'embrione e quindi allontanare l'embrione.
Dopo aver iniettato tutti gli embrioni, questi sono pronti per essere osservati al microscopio confocale con un obiettivo da 60 o 100 x. Un embrione di controllo dovrebbe apparire come quello mostrato in questo filmato. Si tratta di un embrione che esprime la tubulina GFP e l'istone RFP, acquisito con un obiettivo da 100 x su un microscopio confocale a disco rotante.
Il tempo totale indicato è di otto minuti. I grafici della distanza da polo a polo sono molto riproducibili e costituiscono una misura affidabile del successo negli embrioni di controllo. Dovrebbero apparire come quelli mostrati qui per i cicli 11 fino al 13.
Mostrato in questo filmato c'è un altro embrione di controllo. Questo esprime KLP61F-GFP ed è stato iniettato con tubulina rDomine. È stato anch'esso acquisito con un obiettivo 100x su un microscopio confocale a disco rotante, e il tempo totale è di sette minuti.
Questo filmato è stato acquisito immediatamente dopo la microiniezione, e il gradiente nella concentrazione di tubulina r Domine è chiaramente visibile all'inizio del filmato. Questi embrioni possono essere utilizzati per studiare l'inibizione di Klp 61 F dopo la microiniezione dell'anticorpo anti-Klp 61 F. Possiamo osservare la perdita di Klp 61 FGFP dai fusi.
Abbiamo appena mostrato come eseguire microiniezioni in embrioni di Drosophila con incisione. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di effettuare controlli, praticare prima l'iniezione di tampone o rutina da soli e assicurarsi che la mitosi proceda normalmente attraverso la fase cellulare. Una volta che tutte le vostre iniezioni risultano affidabili e non causano danni, potete iniettare un inibitore e studiare l'effetto di quell'inibizione specifica.
Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'uso della microiniezione e dell'analisi con immagini ad alta risoluzione nell'embrione sinciziale di Drosophila melanogaster per lo studio della mitosi. La procedura prevede un'attenta manipolazione degli embrioni per garantire un'analisi e un'acquisizione delle immagini efficaci.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Biologia cellulare
Sfondo
- Drosophila melanogaster è un organismo modello ampiamente utilizzato nella ricerca biologica.
- Comprendere la mitosi è fondamentale per ottenere informazioni sulla divisione cellulare e lo sviluppo.
- Le tecniche di imaging ad alta risoluzione migliorano l'osservazione dei processi cellulari.
- La microiniezione consente una manipolazione precisa degli embrioni ai fini sperimentali.
Scopo dello studio
- Studiare la dinamica della mitosi negli embrioni di Drosophila.
- Utilizzare tecniche di imaging avanzate per osservazioni cellulari dettagliate.
- Stabilire un protocollo affidabile per futuri studi in biologia dello sviluppo.
Metodi Utilizzati
- Collezione di embrioni su piastre con succo d'uva.
- Microiniezione di embrioni per manipolazione sperimentale.
- Immagini ad alta risoluzione per osservare i processi mitotici.
- Manipolazione accurata degli embrioni per prevenire danni durante la preparazione.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita delle fasi mitotiche in embrioni di Drosophila.
- Dimostrata l'efficacia delle tecniche di microiniezione.
- Forniti approfondimenti sui tempi e sulla regolazione della divisione cellulare.
- Stabilita una base per future ricerche sullo sviluppo embrionale.
Conclusioni
- Il protocollo è efficace per lo studio della mitosi negli embrioni di Drosophila.
- L'imaging ad alta risoluzione è fondamentale per comprendere la dinamica cellulare.
- Questo studio contribuisce al più ampio campo della biologia dello sviluppo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente l'analisi funzionale di proteine mitotiche in un sistema in vivo rapido e sincrono, supportando la validazione degli obiettivi attraverso letture fenotipiche dell'inibizione proteica. L'embrione sinciziale di Drosophila fornisce un sistema rilevante per le malattie per la riduzione del rischio meccanicistico di bersagli mitotici, permettendo la valutazione della funzione proteica prima dell'identificazione del capostazione. L'imaging quantitativo della dinamica del fuso offre una previsione affidabile dell'essenzialità del bersaglio e del suo coinvolgimento nel percorso.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche visualizzando fenotipi da perdita di funzione mediante microiniezione di anticorpi specifici per la proteina.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico attraverso serie fenotipiche dipendenti dal gradiente, simili a mutanti allelici.
- Valore predittivo: Facilita la valutazione della fiducia sul bersaglio correlando l'intensità dell'inibizione con la gravità dei difetti mitotici.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera letture standardizzate e riproducibili della mitosi (distanza da polo a polo) per lo screening di composti o inibitori.
- Output quantitativo: Fornisce parametri misurabili basati sull'immagine, che consentono l'analisi dose-risposta dell'inibizione proteica.
- Scalabilità: Permette la preparazione e l'acquisizione parallela di embrioni per una validazione funzionale a medio rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: La conservazione del macchinario mitotico sostiene l'allineamento traslazionale dei biomarcatori con i percorsi di divisione cellulare umana.
- Continuità preclinica: Permette un approfondimento meccanicistico, passando da alterazioni genetiche alla validazione funzionale in un sistema vivente.
- Decisioni basate sul rischio: Aiuta a stabilire le priorità dei bersagli in base alla penetranza fenotipica e alla specificità dell'inibizione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nella fase iniziale della scoperta per validare bersagli mitotici prima delle fasi di sviluppo del saggio e di identificazione dei composti attivi, sfruttando la funzionalità in vivo.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi e la validazione funzionale dei bersagli mediante perturbazione diretta delle proteine mitotiche.
- Screening: Permette la preparazione del saggio attraverso letture standardizzate e quantificabili mediante imaging mitotico.
- Analisi: Fornisce misurazioni oggettive basate sull'imaging (ad esempio, lunghezza del fuso) per confrontare condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega al lavoro preclinico attraverso meccanismi mitotici conservati e conservazione della funzione proteica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la validazione iterativa dei bersagli su diversi regolatori mitotici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella funzione del bersaglio attraverso l'inibizione diretta e reversibile delle proteine in vivo.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità mediante protocolli standardizzati di preparazione e iniezione degli embrioni.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi del bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli in base al rischio, utilizzando gradienti di gravità fenotipica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione degli embrioni, nella microiniezione e nell'immagine confocale in tempo reale.
- Dipende da apparecchiature per microiniezione, oli antiossidanti e sistemi di imaging ad alta risoluzione.
- Necessita di standardizzazione tra gruppi diversi per la stadiazione degli embrioni e la coerenza delle iniezioni.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la solubilità delle proteine, la funzionalità degli anticorpi e la compatibilità dei marcatori fluorescenti.
- I limiti pratici comprendono la vitalità degli embrioni dopo l'iniezione e la presenza di potenziali barriere alla diffusione negli embrioni di maggiori dimensioni.
