A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione
6 luglio 2009
Si tratta di un high-throughput protocollo di crioconservazione degli spermatozoi per zebrafish. Spermatozoi crioconservati utilizzando questo protocollo ha una media del 25% la fertilità fertilizzazione in vitro successive ed è stabile per molti anni.
Ciao, sono Bruce Draper dell'Università della California Davis, dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare, e sono Cecilia Moans della Divisione di Scienze di Base presso il Fred Hutchinson Cancer Research Center di Seattle. Oggi, Cecilia e io illustreremo il protocollo di crioconservazione dello sperma di pesce zebra, una modifica del protocollo originale di Brian Harvey. Vi mostreremo che, lavorando in squadre di due persone, è possibile crioconservare lo sperma di 100 maschi singoli in meno di due ore.
Sebbene vi sia un'ampia variabilità della fertilità dopo la scongelazione, in media otteniamo una fertilità del 25%, e ciò proviene da una libreria criopreservata da oltre sette anni. Cominciamo dunque. Prima di eseguire questa procedura, preparare innanzitutto le soluzioni per la congelazione degli spermatozoi.
La soluzione fisiologica per pesci di Ginsburg viene preparata fresca ogni tre giorni, mentre il mezzo di congelamento viene preparato fresco ogni giorno, con e senza metanolo. La composizione di queste soluzioni è disponibile nelle informazioni supplementari online allegate al presente protocollo. I materiali utilizzati in questo procedimento possono influenzare la velocità di congelamento e scongelamento, il che a sua volta può influire sulla fertilità dello sperma congelato.
Per questo motivo, un elenco dei materiali raccomandati è fornito anche come informazione supplementare online. È preferibile congelare lo sperma su anidride carbonica solida finemente tritata piuttosto che su pellet di anidride carbonica solida. Un modo semplice per tritare l'anidride carbonica solida è avvolgerla in un asciugamano e ridurla in polvere con un martello.
Un metodo più efficiente consiste nell'utilizzare un macinatore a secco di anidride carbonica, come il modello RE due con artigli, per congelare lo sperma di pesce zebra. Per prima cosa, segnare delle provette capillari da 10 microlitri con una penna da laboratorio a livello di 3,33 microlitri, ovvero circa 16,7 millimetri dal fondo; per anestetizzare i maschi, posizionarne da due a quattro in un becher contenente trica diluita e acqua per pesci. La ricetta può essere trovata nel libro sul pesce zebra.
Dopo aver anestetizzato il pesce, sollevarlo dal liquido anestetico utilizzando un cucchiaio di plastica e asciugarlo delicatamente con un tovagliolo di carta. Prestare particolare attenzione all'asciugatura della faccia ventrale. L'acqua attiva gli spermatozoi, quindi è fondamentale asciugare accuratamente intorno all'ika.
Posizionare il pesce sul supporto di spugna con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Se la zona intorno alle pinne pelviche è ancora umida, asciugarla delicatamente con un fazzoletto di carta Kim. Inserire il tubo capillare marcato in un adattatore per pipetta con bocchino di gomma incluso con i tubi capillari.
L'adattatore è un tubo di gomma che presenta un boccaglio a un'estremità e un supporto per capillare all'altra. In alternativa, il tubo capillare può essere collegato a una siringa Hamilton da 50 microlitri. Utilizzando un breve pezzo di tubo in teflon di diametro appropriato, posizionare il maschio sotto la lente d'ingrandimento ed esporre l'apertura urogenitale separando con attenzione le pinne pelviche.
Utilizzando l'estremità del tubo capillare, espellere lo sperma effettuando delicati movimenti di strofinamento lungo i fianchi del pesce con pinzette lisce o comprimendo leggermente i fianchi del pesce con indice e pollice; raccogliere lo sperma nel tubo capillare man mano che viene espulso, applicando una leggera aspirazione. Evitare le feci che potrebbero essere espulse insieme allo sperma. Il volume target di sperma è di 3,3 microlitri.
La quantità minima di sperma accettabile varia a seconda della qualità dello sperma. Lo sperma di buona qualità è bianco e opaco, mentre quello scadente appare acquoso. In generale, la quantità minima accettabile è di un microlitro di sperma di buona qualità, ovvero un terzo della quantità desiderata, oppure di due microlitri di sperma scadente, ovvero due terzi della quantità desiderata.
Se il volume dello sperma non raggiunge il volume target di 3,3 microlitri, è necessario normalizzare il volume fino al segno della penna utilizzando mezzo di congelamento senza metanolo. Se il volume dello sperma ha già raggiunto o superato il segno sulla provetta capillare, procedere al passaggio successivo. Aggiungere ora il crioprotettore allo sperma.
Aspirare il mezzo congelante con metanolo fino al segno arancione. Il volume totale approssimativo è ora di 20 microlitri. Espellere delicatamente la miscela di sperma e crioprotettante su un'area pulita di una capsula di vetro, mescolando delicatamente mediante pipettaggio su e giù per circa quattro volte, evitando di introdurre bolle d'aria.
Aliquotare lo sperma in due provette criogeniche pipettando 10 microlitri della soluzione crioprotettiva per lo sperma sul fondo di ciascuna provetta etichettata. Chiudere rapidamente le provette e immergere ciascuna provetta criogenica in un tubo Falcon da 15 millilitri separato. A temperatura ambiente, chiudere i tubi Falcon e inserirli in anidride carbonica solida finemente polverizzata.
I tubi devono essere inseriti abbastanza in profondità in modo che siano visibili solo i tappi, per tenere traccia dei tubi falcon. Numerarli e registrare l'orario in cui ciascun tubo viene posto nel ghiaccio secco. Lasciare congelare lo sperma nel ghiaccio secco per 20 minuti.
Dopo il congelamento dello sperma, trasferire le due provette criogeniche in un matraccio Dewar contenente azoto liquido, per la conservazione temporanea. Posizionare la scatola del congelatore in un bagno di azoto liquido in modo che i campioni non si riscaldino.
Utilizzare lunghe pinze metalliche per recuperare le provette dal flacone e maneggiarle con guanti criogenici. In alternativa, le provette criogeniche possono essere trasferite direttamente dal ghiaccio secco al congelatore. Se la scatola del congelatore viene mantenuta immersa in azoto liquido all'interno di un contenitore in polistirene per la conservazione a lungo termine, posizionare le provette criogeniche in un congelatore criogenico ad azoto liquido.
Per mantenere la vitalità degli spermatozoi, è fondamentale che le provette siano conservate immerse nell'azoto liquido; le provette conservate nella fase vapore potrebbero perdere vitalità nel tempo. Anche la rapidità è essenziale per preservare la vitalità degli spermatozoi. L'intervallo di tempo tra l'aggiunta del crioprotettore e il posizionamento delle provette sul ghiaccio secco non deve superare i 30 secondi Fecondazione in vitro.
L'utilizzo di sperma criopreservato funziona meglio con due persone. Una persona estrae le uova dalle femmine mentre l'altra scongela lo sperma. Impostare un bagnomaria a 33 gradi Celsius.
Rimuovere una provetta criogenica dal congelatore a azoto liquido e trasferirla in un contenitore D o un matraccio contenente azoto liquido, fino al momento del scongelamento. Espellere le uova da femmine anestetizzate in una capsula di Petri di plastica da 35 millimetri. Questa procedura è descritta in dettaglio nel protocollo JoVE intitolato "Produzione di zebrafish geneticamente gini mediante pressione precoce", che fornisce una descrizione dettagliata del zebrafish.
Fecondazione in vitro, una buona covata contiene più di 150 uova uniformi e di colore giallastro. Eventuali detriti bianchi indicano degradazione. Se possibile, cercare di ottenere tre covate di uova e unirle in un unico contenitore.
Se non si ottengono tre buone covate entro un minuto dalla prima covata, passare al passaggio successivo. Mantenere la piastra coperta mentre lo sperma viene scongelato. Nel frattempo, rimuovere la provetta dall'azoto liquido ed eliminare il tappo.
Immergere rapidamente il vialino per metà in un bagno d'acqua a 33 gradi per otto-dieci secondi. Aggiungere rapidamente 70 microlitri di soluzione salina tamponata di Hank a temperatura ambiente al vialino e mescolare aspirando e dispensando immediatamente nel vialino, quindi aggiungere subito alle uova nella piastra di Petri e mescolare delicatamente con la punta della pipetta. Successivamente, attivare immediatamente spermatozoi e uova aggiungendo 750 microlitri di acqua per pesci, ruotare per mescolare e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo cinque minuti, riempire la piastra con i pesci, aggiungere acqua e incubare a 28 gradi Celsius. Dopo due o tre ore, contare e trasferire gli embrioni vitali in piastre da 100 millimetri, con 50 embrioni per piastra. Contare anche le uova fecondate in modo da poter determinare la fertilità del campione di sperma.
La fertilità degli spermatozoi è il rapporto tra embrioni vitali e il numero totale di uova utilizzate per la fecondazione in vitro. Le uova possono essere selezionate in qualsiasi momento da due a sei ore dopo la fecondazione in vitro. Quando le uova infertili sono facilmente distinguibili dagli embrioni vitali, le uova infertili appaiono chiare e non divise.
Quando osservato con illuminazione trasmessa al microscopio stereoscopico, la fertilità media degli spermatozoi criopreservati varia notevolmente. Tuttavia, dovrebbe essere possibile ottenere una fertilità media del 25%, stabile per diversi anni. Questo grafico mostra la percentuale media di fertilità degli spermatozoi congelati tra il 2001 e il 2003 e testati fino al 2008.
Abbiamo appena dimostrato un metodo ad alto rendimento per la criopreservazione dello sperma di pesce. Eseguendo questo protocollo, è importante utilizzare tutta la plastica e l'attrezzatura raccomandate, nonché utilizzare anidride carbonica solida macinata piuttosto che pellet di ghiaccio secco. È fondamentale utilizzare sperma e uova di qualità molto elevata; nel caso delle uova, durante la fecondazione in vitro, una volta attivato lo sperma, è importante utilizzare il maggior numero possibile di uova per aumentare il numero di embrioni fecondi ottenuti alla fine del processo, il che potrebbe richiedere da tre a quattro femmine, giusto?
Un altro componente fondamentale del protocollo è la velocità. Non dovrebbe mai richiedere più di circa un minuto passare dall'estrazione dello sperma dal maschio al suo posizionamento nell'anidride solida. Bene, credo che sia tutto.
In bocca al lupo per i tuoi esperimenti.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo ad alto rendimento per la crioconservazione dello sperma di pesce zebra, che raggiunge una percentuale media di fertilità del 25% in successivi fecondazioni in vitro. Il protocollo è stabile nel corso di molti anni, consentendo una conservazione a lungo termine efficace dello sperma di pesce zebra.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia della riproduzione
- Tecniche di criopreservazione
Sfondo
- Il pesce zebra è un organismo modello nella ricerca biologica.
- La criopreservazione è essenziale per la conservazione a lungo termine del materiale genetico.
- Il mantenimento della vitalità degli spermatozoi è fondamentale per una fecondazione riuscita.
- I protocolli per la criopreservazione dello sperma possono variare per efficacia.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo ad alto rendimento per la criopreservazione dello sperma di pesce zebra.
- Valutare la fertilità dello sperma criopreservato nel tempo.
- Fornire un protocollo affidabile per i ricercatori del settore.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di soluzioni per il congelamento degli spermatozoi e crioprotettori.
- Prelevamento dello sperma da maschi di zebrafish anestetizzati.
- Congelamento dello sperma utilizzando anidride carbonica solida e azoto liquido.
- Scongelamento dello sperma per la fecondazione in vitro.
Risultati principali
- Tasso medio di fertilità del 25% ottenuto da spermatozoi criopreservati.
- Il protocollo consente la criopreservazione dello sperma di 100 maschi in meno di due ore.
- La vitalità degli spermatozoi viene mantenuta per un periodo superiore ai sette anni.
- Tecniche specifiche migliorano il tasso di successo della criopreservazione.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato è efficiente ed efficace per la criopreservazione dello sperma di pesce zebra.
- È possibile ottenere alti tassi di fertilità con tecniche appropriate.
- Questo metodo può supportare studi genetici a lungo termine nel pesce zebra.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La criopreservazione dello sperma di zebrafish consente una gestione a lungo termine delle risorse genetiche nella scoperta preclinica, sostenendo una disponibilità costante dei modelli per la validazione degli obiettivi e lo screening fenotipico. Il protocollo ad alta produttività permette la criopreservazione di 100 campioni maschili in meno di due ore, migliorando l'efficienza operativa nei repertori genetici su larga scala. Tassi di fertilità stabili del 25% per diversi anni forniscono risultati prevedibili per saggi di fecondazione in vitro successivi, riducendo la variabilità negli esperimenti di incrocio genetico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi genetiche preservando linee di sperma per futuri incroci volti a confermare la funzione genica in sistemi rilevanti per le malattie.
- Valore operativo: Procedure standardizzate di raccolta e congelamento dello sperma riducono la variabilità tecnica, favorendo una riduzione del rischio sui bersagli riproducibile tra diversi laboratori.
- Valore predittivo: La capacità di conservazione a lungo termine consente test retrospettivi di modelli genetici man mano che emergono nuovi bersagli, migliorando la fiducia nella continuità traslazionale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Lo sperma criopreservato fornisce un input biologico uniforme per saggi di fecondazione in vitro, consentendo metriche costanti di conversione da uovo a embrione nell'analisi di composti.
- Valore operativo: L'uso di cryovials invece di tubi capillari migliora la manipolazione e la scalabilità della conservazione dei campioni nei flussi di lavoro ad alto rendimento.
- Prontezza del saggio: Volumi di sperma normalizzati mediante mezzo di congelamento privo di metanolo aumentano l'uniformità procedurale, favorendo risultati quantitativi affidabili nei saggi di fecondazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Tassi di fertilità stabili per sette anni supportano studi preclinici pluriennali che richiedono sfondi genetici costanti per la caratterizzazione del meccanismo d'azione e la valutazione della sicurezza.
- De-risking predittivo: La viabilità dello sperma affidabile riduce il tasso di fallimento nella generazione di modelli genetici, migliorando le percentuali di successo nei percorsi di validazione del target guidati dal fenotipo.
- Sistema rilevante per le malattie: Gli embrioni di zebrafish derivati da sperma criopreservato consentono una rapida valutazione fenotipica in modelli vertebrati allineati ai percorsi delle malattie umane.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo un processo preliminare scalabile per la generazione di embrioni di zebrafish utilizzati nella validazione del bersaglio, nello sviluppo di saggi e nello screening fenotipico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo la generazione su richiesta di embrioni geneticamente definiti da linee di sperma archiviate.
- Screening: Lo sperma criopreservato migliora la riproducibilità e la produttività degli assay negli screening basati sulla fecondazione in vitro per composti o soppressori genetici.
- Analisi: Le misurazioni del tasso di fertilità (embrioni vitali per numero totale di uova) forniscono un parametro quantitativo per valutare la qualità dello sperma e l'efficienza degli incroci genetici.
- Ricerca traslazionale: La conservazione a lungo termine dello sperma garantisce continuità dalla scoperta genica alla validazione preclinica, utilizzando background genetici costanti.
- Riutilizzo aziendale: Il protocollo stabilisce una capacità gestionale di risorse genetiche riutilizzabili per impianti zebrafish su larga scala che supportano progetti multipli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella disponibilità di modelli genetici, riduzione dell'ambiguità meccanicistica negli studi multigenerazionali.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della lavorazione dello sperma che consentono una biobancarizzazione ad alto rendimento.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avvio o meno di investimenti in modelli genetici, efficienza del capitale nel mantenimento di colonie vive, riduzione del rischio biologico negli studi longitudinali.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta per il rischio delle linee genetiche in base ai tassi di successo della criopreservazione e alla stabilità della fertilità a lungo termine.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta esperienza specifica nella manipolazione dei zebrafish, nell'estrazione dello sperma e nelle tecniche di criopreservazione.
- Le attrezzature necessarie includono un macinatore di ghiaccio secco, stoccaggio in azoto liquido, tubi capillari, cryovials e bagni termoregolati per la scongelazione.
- La standardizzazione tra gruppi di lavoro richiede l'adesione a materiali specifici (ad esempio, ghiaccio secco finemente tritato, tubi raccomandati) per controllare le velocità di congelamento e scongelamento, che influenzano la fertilità.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la normalizzazione del volume dello sperma mediante un mezzo di congelamento privo di metanolo, per garantire una preparazione uniforme dei campioni nonostante la variabilità della produzione tra i maschi.
- Limitazioni pratiche: la fertilità varia da campione a campione; il successo del protocollo dipende dalla qualità dello sperma e delle uova, con soglie minime accettabili di volume dello sperma ben definite.
