Preparazione Stendere cromosomiche di cellule staminali embrionali umane per cariotipo

Introduzione. Salve. Siamo dell'Istituto di Scienze Biometriche dell'Università Federale di Faja in Brasile. In questo video prepareremo vetrini cromosomici di cellule staminali embrionali umane per rilevare possibili alterazioni cromosomiche miracolose. Sebbene sia stato dimostrato che le cellule staminali embrionali umane presentano un cariotipo stabile e ben distribuito, numerosi studi hanno riportato che, a seconda delle condizioni di coltura, tendono ad acquisire anomalie cromosomiche come l'aggiunta di cromosomi interi o di parti di cromosomi.

La caratterizzazione dell'integrità genetica di HASS in vitro è fondamentale considerando i suoi importanti utilizzi nello studio dell'embriogenesi e nei test farmacologici. Inoltre, per future proposte terapeutiche, le alterazioni cromosomiche rappresentano una preoccupazione reale poiché sono spesso associate alla carcinogenesi. Cominciamo dunque.

Trattare le cellule con ate. In questa procedura, lo utilizziamo. L'otto o nove ha la linea curata nel F 12 integrato con il 20% di sostituto del siero privo di conteggio e da 80 a nove grammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti. Iniziare rimuovendo la fiasca coltura dall'incubatore e, sotto una cappa a flusso laminare, aggiungere coit a una concentrazione finale di 0,1 microgrammo per millilitro.

L'aggiunta di Coit alla soluzione mediana induce mitosi, riposo e metafase. Quando i cromosomi sono ben condensati e possono essere visualizzati più facilmente al microscopio, assicurarsi di utilizzare tecniche sterili per evitare contaminazioni. Dopo aver aggiunto il Coit, conservare la fiala e reinserire le cellule nell'incubatore.

Dopo il periodo di incubazione, le cellule non sono ancora pronte per essere fissate. Non è necessario lavorare in condizioni sterili. Iniziare aspirando il mezzo e, al termine, aggiungere della tripsina.

Aggiungere lo 0,05% di DTA al matraccio. Assicurarsi di aggiungere una quantità sufficiente di triptasi da coprire completamente la superficie inferiore delle cellule. Chiudere il matraccio e agitare delicatamente per distribuire in modo uniforme.

La tripsina permette alle cellule di incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo i cinque minuti di incubazione a temperatura ambiente, le cellule non dovranno più essere attaccate alla superficie inferiore del fiasco e sarà necessario inattivare la tripsina aggiungendo il mezzo di coltura contenente siero oppure aggiungendo delicatamente siero direttamente sulle cellule. Rimuovere con attenzione il tappo del fiasco e aggiungere il mezzo di coltura o il siero, facendo scorrere il liquido lungo la superficie inferiore del fiasco in modo da ricoprire le cellule.

Pipettare su e giù la sospensione cellulare diverse volte per dissociare completamente le cellule. Trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri, ma prima assicurarsi che le cellule siano state ben dissociate e che la sospensione non contenga grumi cellulari visibili. Una volta completato il trasferimento, chiudere il tubo con il tappo e centrifugare.

Piegare la sospensione per cinque minuti. Dopo la centrifugazione a 800 giri al minuto, dovrebbe formarsi una pellicola cellulare sul fondo del tubo. Avere cura di non disturbare la pellicola cellulare.

Aspirare la sospensione utilizzando una pipetta P1000 fino a quando ne rimangono circa 200 microlitri. Questo volume è intermedio rispetto a Resus. Sospendere il pellet in Resus.

Sospendere il pallet. Agitare delicatamente il tubo con le dita diverse volte. Verificare che le cellule siano state ben sospese controllando che non rimangano grumi di cellule nella soluzione.

A questo punto, la soluzione dovrebbe essere torbida. Successivamente, è necessario aggiungere cinque millilitri di una soluzione di cloruro di potassio 75 millimolare preriscaldata a 37 gradi Celsius. La soluzione ipotonica deve essere aggiunta molto lentamente lungo la parete del tubo mentre si ruota il tubo.

Dopo aver aggiunto i primi tre millilitri, chiudere saldamente il tubo e con attenzione. Omogeneizzare la sospensione cellulare con una soluzione ipotonica ruotando delicatamente il tubo in posizione orizzontale e lentamente.

Procedere aggiungendo lentamente i rimanenti due millilitri nello stesso modo descritto in precedenza. Lo scopo della soluzione ipotonica è aumentare il volume cellulare per permettere lo srotolamento dei cromosomi. Pertanto, questo periodo di incubazione è fondamentale per ottenere una buona diffusione dei cromosomi. Una volta aggiunti tutti e cinque i millilitri, chiudere il tubo con il tappo e incubare le cellule in un bagno termostatato a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Al termine del periodo di incubazione di 15 minuti, rimuovere il tubo dal bagno termostatato. A questo punto, è necessario lavorare sotto cappa, poiché i fumi prodotti dalla soluzione fissativa sono tossici. Se non si dispone di una cappa, assicurarsi di operare in un'area ben ventilata.

Rimuovere il tappo del tubo e aggiungere le tre gocce della soluzione fissativa. Questa è un rapporto 3:1 di metanolo e acido acetico e deve essere preparata nel giorno dell'uso. Chiudere bene il tubo con il tappo e ruotare delicatamente il tubo orizzontalmente, facendolo girare lentamente prima in senso orario, poi in senso antiorario.

Centrifugare il tubo per cinque minuti a 800 giri/min senza frenata. È molto importante che il ciclo di centrifugazione si arresti lentamente per evitare la perdita di materiale causata dall'attrito cellulare dopo la centrifugazione. Questo stato cardio si trova in circa 200.

Per sospensione del palato, agitare delicatamente il tubo con le dita diverse volte. Assicurarsi che le cellule siano state ben sospese verificando che non rimangano grumi cellulari. Aggiungere lentamente la soluzione fissante di tre millilitri lungo la parete del tubo mentre lo si ruota, dopo aver aggiunto i primi tre millilitri.

Chiudere ermeticamente il tubo T e omogeneizzare con attenzione la sospensione cellulare ruotando delicatamente il tubo in posizione orizzontale e facendolo girare lentamente. Assicurarsi di effettuare almeno un'intera rotazione. Per ottimizzare questo processo di miscelazione, aggiungere altro.

Aggiungere due millilitri della soluzione fissante lungo la parete del tubo per raccogliere le cellule. Conservare la sospensione cellulare a quattro gradi Celsius durante la notte. Le cellule fissate possono essere conservate nella soluzione fissante a quattro gradi Celsius per mesi.

Il giorno successivo, lavare le cellule centrifugando le cellule per cinque minuti a 800 g senza arresto graduale. Rimuovere il soprannatante e lasciare un volume residuo di circa 200 microlitri. Sospendere il pellet agitando ripetutamente il tubo con le dita.

Assicurarsi che le cellule siano state ben associate e che la sospensione non contenga grumi cellulari visibili. Aggiungere lentamente cinque millilitri di soluzione fissativa fresca lungo la parete del tubo. Chiudere il tubo con il tappo e omogeneizzare le cellule ruotando delicatamente il tubo in senso orizzontale mentre lo si fa girare lentamente.

Oltre a proteggere le cellule, la soluzione fissativa rimuove i lipidi e denatura le proteine, facilitando così la diffusione dei cromosomi. Centrifugare il campione nel tubo per cinque minuti a 800 RRP M senza freno. Preparazione dei vetrini: al termine della centrifugazione, lasciare una quantità sufficiente di soluzione per omogeneizzare il pellet cellulare.

Questa quantità di liquido può dipendere dal numero di cellule. Agitare delicatamente il tubo con le dita più volte. Assicurarsi che le cellule siano ben dissociate verificando l'assenza di grumi cellulari visibili.

A questo punto, la soluzione dovrebbe essere aggiunta al bersaglio; aggiungere da 20 a 30 microlitri di sospensione cellulare su un vetrino pulito e asciutto spostando la pipetta parallelamente a questa superficie luminosa. Mentre la soluzione fissativa evapora, la superficie luminosa diventa immediatamente granulosa. Esporre questa superficie verso l'alto al vapore di acqua calda per 30 secondi in modo da far gonfiare le cellule.

Analisi di queste preparazioni. Dopo aver preparato questi vetrini, osservarli al microscopio a contrasto di fase utilizzando gli obiettivi 10 e quelli pelosi per verificare se la densità cellulare è adatta ad ulteriori analisi. Questo vetrino è un esempio di preparato troppo concentrato.

Si noti che i nuclei cellulari sono troppo vicini agli allargamenti metafasici. Se si dispone di un vetrino in cui la densità cellulare è troppo elevata, allora diluire la sospensione cellulare aggiungendo ulteriore soluzione fissativa. Questo vetrino mostra la densità cellulare desiderata.

Si noti che le metafasi sono ben disperse e isolate. Una volta ottenuto un vetrino con una densità cellulare ottimale, non può essere colorato e analizzato. Evitare di selezionare le metafasi vicine al nucleo, poiché i cromosomi potrebbero essere nascosti o ostruiti alla vista.

Cercare metafasi arrotondate, ma assicurarsi che nessun cromosoma sia allontanato dalla metafase; scegliere metafasi arrotondate e ben isolate. Come nella diapositiva seguente, cercare di evitare di riportare falsi IES come guadagno di cromosomi generato da due allargamenti eccessivi, oppure la perdita di cromosomi causata da cromosomi allineati.

Speriamo che questo video ti sia utile per i tuoi futuri esperimenti. Se hai dei dubbi, non esitare a contattarci. Buon divertimento e in bocca al lupo.