Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

In questa tecnica, le lamelle di vetro vengono funzionalizzate con una miscela di molecole di PEG inerti e biotinilate. Viene creato una camera di flusso con questa superficie funzionalizzata e posizionata su un microscopio TIRF. I modelli circolari biotinilati vengono legati alla superficie mediante streptavidina multivalente.

Quando i substrati vengono replicati mediante l'aggiunta di proteine della zona di replicazione e nucleotidi, il DNA a doppio filamento risultante viene allungato mediante flusso laminare e visualizzato in tempo reale utilizzando un colorante intercalante. Ciao, sono Nathan Tanner del laboratorio di Antoine Van Ian del Dipartimento di Chimica Biologica e Farmacologia Molecolare della Harvard Medical School. Sono anche Joe Laro del laboratorio Van Noian.

Oggi vi mostreremo un procedimento per l'imaging a fluorescenza della replicazione del DNA in tempo reale a livello di singola molecola. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le attività coordinate di sintesi del DNA nei singoli complessi di replicazione. Cominciamo dunque.

Per iniziare questa procedura, aggiungere l'oligonucleotide con coda biotinilata al DNA a singolo filamento M13 aggiungendo un eccesso dieci volte dell'oligo nel buffer TBS, riscaldare a 65 gradi Celsius, quindi spegnere il blocco termico per consentire un raffreddamento lento e permettere l'annealing corretto del primer. Ora che il primer M13 è pronto, aggiungerlo a una miscela contenente la DNA polimerasi T7 a 64 nanomolar e il buffer di replicazione T7 contenente dNTP e cloruro di magnesio, quindi incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 12 minuti. Al termine dell'incubazione, arrestare la reazione con 100 millimolar di EDTA.

Successivamente, purificare il DNA del prodotto riempito mediante fenolo-isoamile alcol-cloroformio, estrazione e dialisi in tampone TE o un altro tampone di conservazione adatto; effettuare nuovamente l'estrazione di ciascuna fase organica per recuperare qualsiasi primer residuo. Dopo la dialisi, determinare la concentrazione del DNA mediante spettrofotometro UV-vis. Un singolo ciclo di preparazione del template può produrre una concentrazione nanomolare sufficiente di template per centinaia o migliaia di esperimenti su singola molecola.

Ora che il DNA è pronto, procedere alla preparazione dei vetrini funzionalizzati. Il DNA da replicare viene fissato su vetrini di vetro funzionalizzati con Amil Lane, il cui gruppo Ossigeno si lega al vetro lasciando un gruppo amminico disponibile per il legame con molecole di peg biotinilato. Questo rivestimento contribuisce a ridurre il legame non specifico alla superficie.

Per pulire accuratamente i vetrini di vetro, posizionarli nei barattoli per colorazione e riempire i barattoli con etanolo sottoposto a sonica. Risciacquare i barattoli per 30 minuti, quindi riempirli con idrossido di potassio 1 M e sottoporre a sonica per 30 minuti; ripetere entrambi i lavaggi. Per la prima reazione di funzionalizzazione, è necessario rimuovere ogni traccia di acqua.

Riempire i barattoli di colorante con acetone e sottoporre ad ultrasuoni per 10 minuti. Svuotare i barattoli e riempirli nuovamente con acetone. Procedere aggiungendo il reagente sine ai barattoli e agitare per due minuti.

Quindi, spegnere la reazione con un eccesso abbondante di acqua. Successivamente, asciugare le lamelle riscaldandole a 110 gradi Celsius in forno per 30 minuti. Poi, preparare la miscela di PEG a circa lo 0,2% in peso per volume mediante PEG aminato; l'inserimento di un distanziatore di vetro sotto la lamella permetterà la separazione delle lamelle; pipettare 100 microlitri sulla lamella silanizzata e asciutta.

Posizionare un secondo vetrino coprioggetto in alto. Incubare i vetrini coprioggetto nella soluzione di PEG per tre ore. Successivamente, separare ogni coppia di vetrini coprioggetto e lavare abbondantemente con acqua.

Attenzione a mantenere i coprioggetti con il lato funzionalizzato rivolto verso l'alto, poiché solo un lato sarà rivestito con peg. Infine, asciugare i coprioggetti con aria compressa e conservarli sotto vuoto in un essiccatore; le superfici rimangono stabili per almeno un mese. In questo modo, si possono produrre dozzine di coprioggetti in un unico lotto e utilizzarli secondo necessità.

Ora che i coprioggetti sono pronti, è possibile assemblare la camera di flusso per l'esperimento a singola molecola. Iniziare versando da 20 a 25 millilitri di buffer bloccante contenente BSA in un desiccante per rimuovere eventuali bolle d'aria nei passaggi successivi. Successivamente, diluire 25 microlitri di streptavidina in 100 microlitri di PBS e distribuire la soluzione sulla superficie di un coprioggetto funzionalizzato con perni, quindi incubare per 20 minuti a temperatura ambiente per consentire alla streptavidina di legarsi alla biotina superficiale, mentre si preparano le altre parti della camera.

Mentre il vetrino coprioggetto è in incubazione, tagliare un pezzo di nastro adesivo doppio lato con supporto su entrambi i lati in modo che corrisponda alle dimensioni del vetrino in quarzo utilizzato per assemblare la camera di flusso. Segnare la posizione dei fori per i tubi sul nastro con una matita in modo da poter disegnare un contorno della camera di flusso sul nastro. Dopo aver segnato i fori, tracciare un rettangolo largo due millimetri intorno alle marcature.

Questo rettangolo fungerà da canale di flusso, quindi assicurarsi di realizzare lati dritti e di lasciare spazio intorno all'ingresso e all'uscita del tubo. Ora tagliare il nastro segnato lungo il contorno disegnato, effettuando tagli dritti e puliti per garantire che nessun adesivo sporga nel canale. Pulire accuratamente la lamella di quarzo utilizzando acetone per rimuovere l'adesivo residuo della cella a flusso utilizzata negli esperimenti precedenti.

Trova l'allineamento migliore del contorno del canale. Rimuovi un lato del supporto adesivo e posiziona con attenzione il nastro sul vetrino. Presta attenzione ad allineare correttamente il nastro, poiché i fori di ingresso e di uscita devono rimanere liberi da ostruzioni.

Successivamente, preparare i pezzi di tubo tagliati di lunghezza di 0,76 millimetri per l'ingresso e l'uscita della cella a flusso. È utile tagliare l'estremità del tubo con un angolo di circa 30 gradi in modo che il tubo non prema piatto contro il fondo della camera. Sospendere i tubi su portaprovetta per facilitarne il collegamento alla cella a flusso nei passaggi successivi.

A questo punto l'incubazione del vetrino è terminata. Risciacquare accuratamente il vetrino ricoperto da strep avid ENC con acqua ed asciugare utilizzando aria compressa. Fare attenzione a non capovolgere il vetrino, poiché solo un lato è funzionalizzato.

Infine, completare il montaggio della camera a flusso rimuovendo l'altro lato del supporto adesivo e posizionando la lamella di quarzo sul vetrino coprioggetto. Premere leggermente sul vetrino coprioggetto per espellere qualsiasi aria intrappolata nell'adesivo. Questo aiuterà a prevenire la formazione di bolle d'aria nel canale di flusso.

Sigillare i lati della camera con resina epossidica. Inserire il tubo tagliato nei fori del quarzo e fissarlo con resina epossidica, quindi lasciare asciugare per alcuni minuti. Quando il sigillo di resina epossidica è asciutto, iniziare il bloccaggio della superficie.

Utilizzando un ago da 21 gauge. Aspirare un po' del buffer di bloccaggio Degas attraverso una delle provette. Lavare alcune volte per rimuovere le bolle d'aria e lasciare incubare la camera per almeno mezz'ora prima di passare all'esperimento di replicazione a singola molecola.

Ora che la cella a flusso è stata bloccata, posizionarla sul palchetto del microscopio. Fissare la camera con le clip del palchetto e assicurarsi che il canale di flusso sia allineato lungo l'asse y. Collegare il tubo di uscita della cella a flusso alla pompa per siringhe utilizzando un tubo connettore di diametro maggiore.

Posizionare l'ingresso nel buffer di blocco e tirare indietro la siringa per rimuovere qualsiasi aria presente nel tubo. Un leggero colpetto sul tubo di uscita aiuterà a eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate nella cella di flusso. Aggiungere ora il DNA, diluire il template di DNA stock a 25 picomolari in un millilitro di buffer di blocco e farlo fluire nella camera a una velocità moderata, ad esempio 0,025 millilitri al minuto per 30 minuti, per consentire un'adeguata copertura della superficie da parte del DNA.

Una volta che il DNA è nella camera, rimuovere il DNA in eccesso eseguendo un lavaggio con buffer bloccante per almeno 200 volumi della cella di flusso. Per eliminare tutto il DNA libero, accendere il laser e la telecamera. Il CCD refrigerato deve raggiungere la temperatura richiesta prima di poter essere utilizzato.

Dopo aver rimosso l'eccesso di DNA e disgassato il buffer di replicazione, preparare la miscela di reazione per la replicazione con nucleotidi, DTT e citossina nel buffer di replicazione. Quindi aggiungere le proteine e mescolare delicatamente. Successivamente, far fluire la miscela di reazione nella cella di flusso.

La velocità del flusso deve essere sufficiente per allungare il DNA a doppio filamento in un canale di flusso largo due millimetri e alto 100 micrometri; una portata di 0,04 millilitri al minuto funziona bene. Attendere il tempo necessario affinché la miscela entri nella camera, circa 10 minuti.

Spostare il campo visivo sul lato del canale e mettere a fuoco sul materiale adesivo per assicurarsi di essere vicini alla superficie, necessario per la messa a fuoco e per iniziare l'acquisizione delle immagini. Regolare la potenza del laser, la messa a fuoco del microscopio e l'angolo del campione. Mantenere la potenza bassa per evitare qualsiasi scissione fotoindotta del DNA marcato.

Acquisire da uno a cinque fotogrammi al secondo per diversi minuti, a seconda della velocità di replicazione del DNA. Ripetere per ottenere traiettorie di replicazione più lunghe o spostarsi in un nuovo campo per osservare più molecole quando quasi tutta la miscela di reazione è stata pompata nella cella; aggiungere ulteriore tampone con citocromo c per visualizzare altri campi. L'acquisizione di più immagini di diverse molecole replicate fornisce dati statistici per la determinazione della produttività.

Nel saggio di replicazione a cerchio rotante, la sintesi del filamento principale estende la coda che collega il cerchio alla superficie; la coda viene quindi convertita in DNA a doppio filamento dalla polimerasi del filamento ritardato e stirata dal flusso laminare, come mostrato. Di seguito è riportato un esempio di campo visivo con citrosina arancione a eccitazione di 532 nanometri.

I piccoli punti fluorescenti sono substrati non replicati ancorati. Si noti l'elevata lunghezza dei prodotti e il gran numero di prodotti per campo. Un campo tipico mostrerà numerose molecole in replicazione, visibili come linee luminose crescenti di DNA colorato. Negli esperimenti con E. Coli a 37 gradi Celsius si osservano da cinque a cinquanta molecole per campo, a seconda della densità superficiale.

La zona di replicazione T7 si inizia in modo molto più efficiente e replicherà oltre il 50% delle molecole in un campo. Con una densità così elevata, è difficile risolvere singole molecole come mostrato qui. Pertanto, eseguire l'esperimento con T7 a concentrazioni proteiche più basse o a minore densità superficiale. I grafici Chime di molecole replicanti tipiche provenienti da esperimenti con E. coli e T7 includono le traiettorie finali di molecole da E. coli e T7 riportate in funzione del tempo. Le traiettorie sono adattate mediante regressione lineare per ottenere le velocità di replicazione, che in questo esempio sono di 467,1 paia di basi al secondo per E. coli e di 99,4 paia di basi al secondo per T7.

Per T7, le distribuzioni delle velocità delle traiettorie di singole molecole, adattate con singole gaussiane, forniscono una media di 535,5 ± 39 paia di basi al secondo per E. coli e di 75,9 ± 4,8 paia di basi al secondo per G7. Per T7, le distribuzioni delle lunghezze dei prodotti di replicazione sono state adattate con un decadimento esponenziale singolo per ottenere la produttività, pari a 85,3 ± 6,1 chilopaia di basi per E. coli e 25,3 ± 1,7 chilopaia di basi per G7. Abbiamo appena mostrato come misurare la replicazione del DNA coordinata mediante singole molecole.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di funzionalizzare correttamente le lamelle e di realizzare canali di flusso puliti e lineari. Assicurarsi di mantenere bassa la potenza del laser e di minimizzare la scissione fotoindotta del DNA lungo. Questo è tutto.

Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.