Assemblaggio, carico, allineamento e di una cella analitica del campione Ultracentrifuga
5 novembre 2009
Il ultracentrifuga analitica (AUC) delle cellule del campione tiene campione e tampone di riferimento e durante gli esperimenti, ed è esposto a alto vuoto e velocità del rotore fino a 60.000 giri al minuto. Questo video dimostra l'attenzione rigorosa ai dettagli necessari per l'assemblaggio, il caricamento e l'allineamento di questa componente molto importante di un esperimento AUC.
Ciao, sono Andrea Balbo. Lavoro nel gruppo di Peter Schuck presso gli Istituti Nazionali di Sanità. In questo video, vi mostreremo le nostre procedure per il montaggio, il caricamento e l'allineamento del rotore di una cella campione per ultracentrifuga analitica.
Iniziamo. Ecco i componenti di una cella campione per ultracentrifuga analitica. All'interno del contenitore della cella è inserito un inserto centrale in epon con settore doppio da 12 millimetri e campo in carbone attivo, che verrà inserito tra due insiemi di finestre. Ciascun insieme di finestre è composto da una guarnizione, da un rivestimento e da una finestra alloggiati nel supporto della finestra.
Questi pezzi verranno quindi inseriti all'interno dell'alloggiamento della cella allineando le loro scanalature con la chiave presente all'interno del cilindro dell'alloggiamento, una guarnizione dell'alloggiamento e infine un anello a vite chiuderà la cella del campione con una pressione di coppia compresa tra 120 e 140 inch-pound. Dopo aver caricato il campione, due guarnizioni del tappo dell'alloggiamento e un tappo dell'alloggiamento sigillano i fori di carico della cella per evitare artefatti durante la scansione, perdite e rotture durante gli esperimenti; è fondamentale che tutti i componenti siano puliti, asciutti, privi di polvere e nelle migliori condizioni possibili, ispezionati frequentemente e sostituiti quando necessario. Saranno inoltre necessari i seguenti elementi: un ultracentrifugo analitico, un rotore in titanio a quattro fori, una bilancia da laboratorio, una chiave dinamometrica con quadrante leggibile e un supporto per chiave dinamometrica, un contrappeso e pesi per contrappeso, un cacciavite a testa piatta, una pinzetta, una pipetta da 200 microlitri dotata di punta lunga e conica, strumenti per l'allineamento e lubrificante per rivestimento rotante.
Iniziamo la costruzione del campione cellulare assemblando due gruppi finestra. Posizionare innanzitutto una guarnizione finestra nella parte inferiore del supporto della finestra. Successivamente, posizionare il rivestimento della finestra, talvolta chiamato cuscino della finestra, all'interno del supporto in modo che l'apertura del rivestimento sia opposta alla scanalatura del supporto, con un leggero angolo.
Quindi posizionare la finestra nel supporto, allineando il segno di riferimento sulla finestra con la scanalatura del supporto. Premere delicatamente lungo i bordi estremi su entrambi i lati della finestra. Per garantire una corretta tenuta e un preciso funzionamento della cella del campione, applichiamo leggermente del lubrificante sulla guarnizione alloggiata nell'anello filettato.
Con il lubrificante per spin coat, stendere una quantità molto piccola di spin coat tra pollice e indice. Applicare sui filetti dell'anello a vite uno strato sottile e invisibile di spin coat. Procedere allo stesso modo con la guarnizione dell'alloggiamento.
Rimuovere qualsiasi lubrificante visibile. Per iniziare il montaggio della cella del campione, inserire un'unità finestra con la finestra rivolta verso l'alto, in direzione dell'operatore, all'interno del corpo della cella, allineando la scanalatura con la linguetta del corpo.
Allineare la linguetta centrale con la scanalatura della carcassa e lasciarla cadere delicatamente sull'insieme della finestra all'interno della carcassa. Non utilizzare mai alcun tipo di utensile per spingere la parte centrale all'interno della carcassa della cella. Ciò potrebbe causare danni permanenti alla parte centrale, provocando perdite durante gli esperimenti.
Ruotare il secondo gruppo finestra in modo che la finestra sia rivolta verso il pezzo centrale e lontano da voi. Allineare la scanalatura con la chiavetta del corpo e farla scorrere verso il basso sopra il pezzo centrale. Posizionare la guarnizione del corpo in alto.
Quindi un anello a vite in modo che la parola "out" sia visibile. Utilizzando le dita. Poi uno strumento di allineamento, serrare a mano l'anello a vite.
A volte il pezzo centrale non scivola facilmente all'interno del cilindro di alloggiamento. È possibile innanzitutto allinearli, quindi posizionare il secondo gruppo finestra sopra di esso. Applicando una leggera pressione verso il basso sul gruppo finestra.
È possibile inserire entrambi nella loggia della cella contemporaneamente. In questo modo evitiamo di premere direttamente sul pezzo centrale. Ora è un buon momento per controllare la cella alla ricerca di polvere, lanugine e impronte digitali.
Noterai anche gli anelli di Newton, che indicano la presenza di aria tra il pezzo centrale e le finestre. Questi scompariranno dopo aver serrato con l'anello a vite e la parola "out" visibile. Inserisci completamente la cella del campione all'interno della cella.
Serrare le collette della piastra di serraggio. Tenere ferma la cella applicando una pressione costante sulla leva della piastra di serraggio. In un unico movimento continuo, serrare l'anello a vite a un valore compreso tra 120 e 140 inch pound.
Rilasciare la manopola del supporto per la coppia e rimuovere con attenzione la cella del campione. Carichiamo abitualmente un volume di 400 microlitri in ciascun settore del centrocampista da 12 millimetri. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, posizionare la cella del campione con i fori di caricamento rivolti verso l'alto e la parola "out" sull'anello a vite visibile.
Fare scorrere la punta della pipetta a metà del settore centrale sinistro attraverso i fori di caricamento ed erogare lentamente 200 microlitri di soluzione di riferimento. Ripetere una volta fino a un volume totale di 400 microlitri, utilizzando la stessa punta della pipetta e la stessa tecnica con attenzione e lentamente. Riempire il settore centrale destro con 400 microlitri di soluzione campione.
È fondamentale abbinare i volumi delle soluzioni di riferimento e del campione il più possibile. Applicare saldamente la punta della pipetta alla pipetta, caricare ed erogare lentamente le soluzioni, evitare bolle durante il caricamento e utilizzare la stessa punta della pipetta per entrambe le soluzioni contribuisce a mantenere i volumi uguali per sigillare la cella.
Inserire saldamente due guarnizioni dei tappi del corpo rosso in ciascun foro di carico, assicurandosi che siano posizionate con attenzione tra il pezzo centrale e il corpo in alluminio. Coprire ogni foro di carico con un tappo del corpo e avvitare a mano usando un piccolo cacciavite a testa piatta. Prima di caricare il rotore, verificare che il contrappeso e la cella che si troverà opposta al contrappeso abbiano un peso che differisca al massimo di 0,5 grammi.
Partire con la bilancia a zero. Pesare prima una cella campione che sarà posizionata opposta al contrappeso. Azzerare la bilancia per sottrarre il peso della cella campione.
Pesare quindi il contrappeso. In questo caso, si osserva che il contrappeso è 4,193 grammi più leggero rispetto alla cella del campione. Selezionare un peso di contrappeso da quattro grammi e avvitarlo nel foro di attacco del contrappeso, assicurandosi che non sporga dalla parte superiore.
Pesare il contrappeso per assicurarsi che il peso finale sia entro 0,5 grammi. Utilizzando un rotore a quattro fori, posizionare il contrappeso nella posizione quattro in modo che la freccia bianca sia visibile e punti nella direzione della forza centrifuga. Utilizzando uno strumento di allineamento, verificare che sia completamente inserito all'interno del rotore.
Posizionare la cella del campione della bilancia con i tappi della carcassa rivolti verso il centro del rotore e la parola "out" sull'anello a vite visibile. Utilizzando nuovamente uno strumento di allineamento, assicurarsi che sia completamente inserita all'interno del rotore, osservando dal basso il rotore.
Allineare l'interno. Tracciare, con l'aiuto di un tracciante, il segno più vicino al centro del rotore utilizzando il segno di riferimento presente sul contrappeso mediante uno strumento di allineamento. In modo analogo, allineare la cella del campione nella posizione due.
Dopo che tutte le cellule sono state allineate, il rotore è pronto per essere posizionato nella camera della centrifuga.
Panoramica
In questo video viene illustrata l'assemblaggio, il caricamento e l'allineamento della cella campione per ultracentrifuga analitica (AUC), un passaggio fondamentale per gli esperimenti di AUC. Viene sottolineata l'importanza di un'adeguata manipolazione e preparazione dei componenti della cella campione per garantire risultati accurati.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ultracentrifugazione analitica
- Metodi biofisici
- Tecniche di preparazione dei campioni
Sfondo
- La cella campione AUC è essenziale per condurre esperimenti ad alte velocità del rotore.
- È composta da più componenti che devono essere assemblati con precisione.
- È fondamentale mantenere pulizia e un allineamento corretto per evitare artefatti sperimentali.
- Comprendere il processo di assemblaggio è fondamentale per i ricercatori che utilizzano l'AUC.
Scopo dello studio
- Fornire una guida dettagliata per l'assemblaggio e il caricamento di una cella campione per l'ultracentrifugazione analitica (AUC).
- Evidenziare l'importanza di una preparazione meticolosa negli esperimenti di AUC.
- Garantire che i ricercatori possano riprodurre il processo con precisione.
Metodi Utilizzati
- Assemblaggio degli elementi della finestra e del componente centrale nella cella del campione.
- Applicazione di una coppia per fissare i componenti della cella del campione.
- Caricamento delle soluzioni di riferimento e del campione nella cella.
- Bilanciamento della cella del campione con un contrappeso per misurazioni accurate.
Risultati principali
- Assemblaggio corretto della cella campione per AUC dimostrato nel video.
- Le tecniche di caricamento appropriate garantiscono un numero minimo di bolle e volumi uguali.
- Le regolazioni del contrappeso sono fondamentali per una prestazione accurata del rotore.
- Gli indicatori visivi, come gli anelli di Newton, aiutano a valutare la qualità dell'assemblaggio.
Conclusioni
- Un'attenzione meticolosa nei dettagli durante il montaggio della cella del campione è essenziale per gli esperimenti di AUC.
- Il rispetto delle procedure descritte può migliorare l'affidabilità sperimentale.
- Si raccomandano manutenzione regolare e ispezione dei componenti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'assemblaggio e l'allineamento corretti delle celle del campione per ultracentrifuga analitica sono fondamentali per generare dati biofisici affidabili sulle dimensioni, la forma, la purezza e gli stati di oligomerizzazione delle proteine. Una preparazione accurata delle celle del campione riduce al minimo gli artefatti sperimentali, garantendo l'integrità dei dati per la validazione dei bersagli e gli studi meccanicistici nelle fasi iniziali della scoperta di farmaci. Questo rigore procedurale sostiene la fiducia predittiva nei flussi di lavoro successivi di screening e ottimizzazione dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente la determinazione precisa degli stati di oligomerizzazione proteica e delle interazioni proteina-proteina, fornendo direttamente informazioni per le ipotesi di validazione del target.
- Valore operativo: Fornisce una valutazione in assenza di marcatori, in soluzione, delle proprietà macromolecolari in condizioni prossime a quelle native.
- Valore predittivo: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella riduzione del rischio del target fornendo coefficienti di sedimentazione quantitativi e parametri di forma.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce dati sulla dimensione e forma idrodinamica essenziali per la formulazione dei tamponi saggio e la valutazione della stabilità.
- Valore operativo: Garantisce l'integrità e la monodisperseità del campione, fondamentali per saggi biochimici e cellulari riproducibili.
- Integrazione della piattaforma: Supporta la caratterizzazione biofisica di bersagli purificati prima di campagne di screening ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Consente la valutazione della formazione di complessi proteici e dei cambiamenti conformazionali rilevanti per i meccanismi delle malattie.
- Valore operativo: Supporta i controlli di coerenza tra diversi lotti di proteine ricombinanti utilizzate in modelli preclinici.
- Continuità traslazionale: Collega la caratterizzazione biofisica della proteina bersaglio con saggi funzionali in sistemi rilevanti per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il flusso di lavoro della cella campione dell'ultracentrifuga analitica si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione della proteina bersaglio all'identificazione del composto attivo, fornendo letture biofisiche che guidano decisioni di avanzamento o interruzione basate sul comportamento e sulla stabilità del bersaglio.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi relative all'oligomerizzazione del bersaglio e alle reti di interazione, consentendo una riduzione del rischio biologico prima dello sviluppo del saggio.
- Screening: Garantisce la monodispergione e la stabilità del bersaglio, influenzando direttamente la prontezza del saggio e la qualità dei dati nelle campagne di screening.
- Analisi: Produce misurazioni quantitative del coefficiente di sedimentazione e del peso molecolare che permettono il confronto tra stati proteici in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la caratterizzazione biofisica del bersaglio purificato alla validazione funzionale in modelli preclinici attraverso una qualità costante del materiale.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità standardizzata e riutilizzabile per la caratterizzazione biofisica su multipli bersagli e progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nelle proprietà del target, riduzione dell'ambiguità meccanicistica e maggiore rigore nella validazione del target.
- Valore operativo: Preparazione standardizzata dei campioni, riproducibilità tra diverse prove e scalabilità tra laboratori diversi.
- Valore strategico: Decisioni di avanzamento o interruzione del progetto più informate, riduzione dei tassi di fallimento dovuti all'instabilità del target e maggiore efficienza nell'uso del capitale nella fase iniziale della scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione dei target aggiustata per il rischio, basata su dati di riduzione del rischio biofisico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche biofisiche e nell'uso preciso di componenti ottici.
- È dipendente da strumentazione per ultracentrifuga analitica, chiavi dinamometriche, strumenti di allineamento e manipolazione dei campioni compatibili con ambienti puliti.
- Necessita di standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di pulizia, assemblaggio e applicazione della coppia.
- Comporta considerazioni adattative per diversi tipi di campione, condizioni di tampone e geometrie dei camere centrali.
- È limitata dalla fragilità dei componenti; finestre e camere centrali sono soggette a danni da particelle, coppia eccessiva o errata, o cattivo allineamento.
