Una tecnica di visualizzare contemporaneamente Virus specifiche cellule CD8 + T e cellule infettate da virus In situ

Combinando ibridazione in situ e colorazione con tetramero in una tecnica nota come ISTH, è possibile determinare i numeri relativi e le relazioni spaziali tra le cellule effettrici immunitarie specifiche per l'antigene virale e le cellule e i tessuti infettati dal virus. ISTH inizia incorporando tessuto fresco infettato da SIV in agarosio. Il tessuto viene tagliato in sezioni spesse 200 micron utilizzando un vibratomo e colorato per l'antigene virale.

Cellule CD8+ specifiche mediante tetramer MHC marcati con fitC. Dopo il congelamento, questi preparati colorati vengono ulteriormente sezionati in sezioni spesse otto micrometri utilizzando un criostato ed viene eseguita un'ibridazione in situ per localizzare le cellule infettate dal virus. Si utilizza la microscopia confocale per acquisire immagini delle sezioni doppio colorate e ricostruire infine le sezioni spesse originali, al fine di rivelare la relazione tra cellule effettrici immunitarie e cellule bersaglio.

L'utilizzo di questa procedura per esaminare l'infezione precoce da SIV si è rivelato un buon predittore della gravità della malattia conseguente. Ciao, sono Chinen Lee del laboratorio di Ashley HA del Dipartimento di Microbiologia dell'Università del Minnesota. Sono Pam Skinner, professoressa associata del Dipartimento di Scienze Biomediche Veterinarie dell'Università del Minnesota.

Oggi vi mostreremo una procedura per l'ibridazione in situ all'interno dell'istituto, abbreviata in ISTH. Oltre all'utilizzo della colorazione con tetramero in situ abbinata all'ibridazione in situ, come stiamo dimostrando oggi, usiamo regolarmente anche la colorazione con tetramero in situ combinata con immunohistochimica per determinare la localizzazione, l'abbondanza e il profilo di espressione proteica delle cellule T CD8 specifiche per l'antigene direttamente nei tessuti. A supportarci oggi nella colorazione con tetramero in situ su sezioni spesse saranno il dottor Heon Kim e Terry Matala, mentre per la preparazione delle sezioni sottili e l'ibridazione in situ ci assisterà So iniziamo.

Per iniziare questa procedura, raffreddare il bagno Vibram contenente PBSH sterile a circa due gradi Celsius. Impostare l'angolo della lama del vibratome a 27 gradi. Ogni volta che possibile, mantenere i tessuti freschi raffreddati su ghiaccio e iniziare la procedura entro 24 ore dal prelievo dei tessuti.

Per ridurre al minimo il degrado da raffreddamento, il vibram facilita inoltre il taglio di un tessuto fresco: rimuovere il tessuto connettivo e suddividere il campione con un bisturi in piccoli pezzi, quindi posizionare i frammenti in una cassetta per inclusione e coprirli con agarosio al 4% a basso punto di fusione in PBS, fuso a circa 40 gradi Celsius. Assicurarsi che il tessuto sia a contatto con il fondo della piastra e premere verso il basso i pezzi di tessuto se galleggiano; lasciare solidificare sul ghiaccio per tre-cinque minuti.

Qui si sta utilizzando tessuto splenico, ma linfonodo, vagina, cervice, utero o altri tessuti freschi possono essere utilizzati con un bisturi. Tagliare gli agar intorno al tessuto e, utilizzando pinzette, trasferire con cura il tessuto immerso in agar sul blocco di tessuto. Procedere rivestendo un blocco di tessuto Vibram con colla Loctite.

Non spostare il frammento di tessuto una volta posizionato sul blocco di tessuto. Lasciare asciugare per circa 10 minuti sul ghiaccio. Successivamente, montare il blocco di tessuto nel vibratomo e tagliare il tessuto in sezioni spesse 200 micrometri utilizzando una velocità di avanzamento molto lenta e un'ampiezza relativamente elevata.

Utilizzare un pennello per trasferire le sezioni tagliate in una camera tissutale specializzata posizionata nel pozzetto di una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti, precedentemente riempita con un millilitro di PBSH freddo. Inserire fino a quattro sezioni di tessuto in ogni camera tissutale. Etichettare i campioni e fissare il coperchio alla piastra con un elastico al fine di colorare le sezioni tissutali per le cellule T specifiche per il virus.

I tetrameri coniugati con ZI vengono prima diluiti nel buffer di blocco a circa 0,5 microgrammi per millilitro. La soluzione viene trasferita in una piastra a 24 pozzetti, aggiungendo un millilitro per pozzetto. Il tessuto appena tagliato viene trasferito nella piastra all'interno delle camere per tessuti e lasciato agitare per tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Mantenere un pozzetto vuoto tra le camere dei tessuti contenenti campioni diversi per prevenire contaminazioni incrociate delle soluzioni nei passaggi successivi. In questo passaggio è possibile aggiungere anticorpi diretti contro proteine extracellulari o della superficie cellulare. Per il lavaggio, preparare una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti contenente PBSH freddo dopo l'incubazione primaria.

Lavare due volte trasferendo le camere per tessuti in una piastra pre-riempita per 20 minuti ogni volta, assicurandosi di drenare la maggior parte del liquido dalle camere prima del trasferimento. Inoltre, evitare di far cadere il contenuto di un campione nell'altro durante lo spostamento delle camere e controllare attentamente le sezioni all'interno delle camere per verificare che non si attacchino alle pareti. Fissare le sezioni con paraformaldeide fresca al 4% in PBS per due ore a temperatura ambiente dopo la fissazione.

Lavare due volte con PBSH freddo per cinque minuti ogni volta per amplificare il segnale proveniente dai tetrameri. Incubare le sezioni con anticorpi anti-fitzy di coniglio in un rapporto di uno a 10.000 in buffer di blocco per uno a tre giorni. A questo stadio, è possibile aggiungere anticorpi contro epitopi intracellulari.

Assicurarsi di permeabilizzare le cellule e bloccare i siti non specifici prima dell'aggiunta dell'anticorpo. Potrebbe essere necessaria anche la ripristino dell'antigene dopo la seconda incubazione prolungata finalizzata ad amplificare il segnale. Lavare le sezioni in PBSH tre volte per almeno 20 minuti e fino a diverse ore ogni volta.

Eseguire un'incubazione finale con opportuni anticorpi marcati con fluorocromi. Ad esempio, si può utilizzare l'anticorpo secondario caprino anti-coniglio SI3 per legare gli anticorpi anti-FITZy di coniglio e far sì che la colorazione con tetramero emetta fluorescenza rossa. Se sono stati utilizzati anticorpi murini per la controcolorazione di proteine di interesse, come CD8 per visualizzare le cellule T citotossiche, si può usare caprino anti-topo Alexa 488 per legare gli anticorpi murini e indurre una fluorescenza verde nelle cellule colorate. Le diluizioni di ciascun anticorpo devono essere determinate empiricamente.

Incubare per uno a tre giorni, mantenendo le sezioni protette dalla luce avvolgendo le piastre nella carta stagnola durante questa incubazione e successivamente, poiché la luce quencha i fluorocromi. Infine, fissare nuovamente le sezioni per stabilizzare i tetrameri e gli anticorpi in posizione. Lavare e montare su un vetrino microscopico con gelatina glicerolata contenente quattro milligrammi per millilitro di N-propil gallato, per lo stoccaggio a meno 20 gradi Celsius fino alla preparazione di sezioni sottili per ibridazione in situ.

Le sezioni colorate con il tetramero in situ possono ora essere analizzate mediante microscopio confocale al fine di determinare la localizzazione, l'abbondanza e il profilo di espressione proteica delle cellule T CD8+ specifiche per l'antigene. Nell'immagine mostrata, sezioni di tessuto splenico provenienti da un macaco infetto da SIV sono state colorate con tetrameri Gag per etichettare le cellule T CD8+ specifiche per SIV, nonché con anticorpi anti-CD20 e anti-CD3. Poiché la controcolorazione con anticorpi andrà perduta nel passaggio successivo, è fondamentale analizzare i tetrameri in situ prima di procedere oltre.

Iniziare la procedura di taglio di sezioni sottili riscaldando le sezioni spesse 200 micron a 70 gradi Celsius per cinque minuti su un blocco termoconduttivo, al fine di staccare le sezioni spesse dal vetrino. Una volta staccate le sezioni, incorporarle in OCT su ghiaccio secco riempiendo prima il fondo dello stampo di plastica con OCT. Quindi posizionare il tessuto sopra l'OCT e ricoprirlo con OCT.

Utilizzare un criostato per tagliare sezioni dello spessore di otto micron dai campioni inclusi in OCT e aderire le sezioni di otto micron su vetrini silanizzati. I vetrini possono quindi essere conservati a meno 80 gradi Celsius in una scatola sigillata per successiva ibridazione in situ. L'ibridazione in situ standard viene utilizzata per rilevare le cellule infettate da virus mediante sonde riboprobes specifiche per il virus marcate con S 35.

La procedura include inoltre il rivestimento delle sezioni con emulsione nucleare sensibile alle tracce e il montaggio dei vetrini. Le immagini confocali vengono acquisite in un mezzo paraffinato compatibile con la fluorescenza utilizzando un microscopio confocale BioRad MRC 1000, dotato di un dispositivo di riflessione epi tubo blu. La colorazione con tetramero in situ viene visualizzata utilizzando EPI one 605 per il fluorocromo rosso del tetramero e EPI 2 522 DF 32 per il fluorocromo verde CD otto per ibridazione in situ.

Utilizzare la riflessione blu EPI per i granuli d'argento risultanti dal segnale di ibridazione in situ negli autoradiogrammi sviluppati. Per iniziare l'acquisizione delle immagini, acquisire le immagini da ciascuna sezione da sinistra a destra e dall'alto verso il basso, assicurandosi di catturare ogni immagine con un'overlap approssimativa del 20% rispetto alle immagini adiacenti. Per evitare lacune nell'immagine composita ricostruita, assegnare a ciascuna immagine un nome in base alla sua riga e colonna in un file Excel.

Al termine della raccolta dei dati dai vetrini, utilizzare il software assistente confocale per proiettare le immagini Z seriali di ogni canale in un'unica immagine mediante una procedura in Photoshop a sette passaggi disponibile presso gli autori, quindi unire automaticamente le immagini proiettate dei tre canali in un'unica immagine RGB. Successivamente, assemblare le immagini unite in strati per generare un'immagine composita dell'intera sezione. Associare singoli granuli d'argento e la colorazione con tetramero alle cellule nella composizione utilizzando Metamorph o Photoshop.

Assegnare le coordinate XY dei centri o dei OID delle cellule positive all'RNA virale e delle cellule positive al tetramero. Esportare i dati OID in file Excel come numeri numerici per ogni cellula e utilizzare i dati raccolti nei file Excel per determinare i rapporti tra cellule effettrici immunitarie o cellule e e cellule bersaglio virali o cellule T, in base al numero totale di cellule positive al tetramero e positive all'RNA virale nella sezione, al fine di catturare le relazioni spaziali tra cellule positive al tetramero e cellule positive all'RNA. Copiare e incollare i rispettivi grafici dai file Excel in un documento Photoshop in Photoshop.

Ridurre l'opacità di un livello per allineare e ridimensionare le griglie in modo che coincidano colore, selezionare, quindi copiare e incollare in un nuovo livello. Le posizioni delle cellule positive all'RNA blu scartano il livello utilizzato per allineare le griglie e le posizioni delle cellule positive al tetramero e delle cellule positive all'RNA virale verranno rivelate nell'immagine appiattita. Utilizzando il metodo ISTH qui mostrato, siamo in grado di seguire la risposta immunitaria all'infezione da SIV dopo inoculazione intravaginale in questa porta di ingresso e nei tessuti linfatici ai quali l'infezione si diffonde.

Ci sono grandi numeri di cellule infette in questi siti tissutali a 10 giorni post-infezione, ma anche fino a tre giorni dopo, ci sono cellule positive alla colorazione verde CD A, ma non ancora cellule positive al tetramero specifico per SIV colorate di rosso. La risposta immunitaria è quindi troppo tardiva per eliminare l'infezione.

Tuttavia, a tre settimane dopo l'infezione, si osserva chiaramente una diminuzione delle cellule infette, in particolare al punto di ingresso. Abbiamo utilizzato ISTH per dimostrare che l'entità della riduzione era correlata alla prossimità spaziale e ai numeri relativi delle cellule effettrici immunitarie positive al tetramero. Cellule bersaglio positive per N-S-I-V-R-N-A, che chiamiamo rapporto E:T in vivo.

Le relazioni spaziali sono facilmente visualizzabili con questo metodo, in cui le cellule effettrici sono in rosso e i bersagli virali in blu in questo linfonodo infetto. Molte cellule effettrici e bersaglio sono in prossimità ravvicinata e ci sono aree in cui numerose cellule effettrici circondano una singola cellula positiva per S-I-V-R-N-A, mentre in altre aree una cellula positiva per S-I-V-R-N-A è isolata. Il rapporto ETT viene semplicemente calcolato determinando le posizioni delle cellule e registrandole nel file Excel in base al numero di ciascuna.

Il miglior controllo dell'infezione virale è correlato a un eccesso notevole di effettori rossi rispetto ai bersagli verdi, in un rapporto di 43 a uno. In questo caso, nella cervice e nella vagina, dove l'infezione ha avuto inizio, i rapporti ETT erano inferiori nei linfonodi. La correlazione positiva tra alti rapporti ETT e riduzione del carico virale rispetto al picco indica che una risposta immunitaria più robusta alla porta di ingresso si traduce in un migliore controllo dell'infezione.

Abbiamo appena mostrato come rilevare simultaneamente le cellule CDAT molto specifiche e le cellule infette dal virus in situ. Questa tecnica ci consente di visualizzare contemporaneamente le cellule T specifiche per l'antigene e le cellule infette dal virus nei tessuti. Questa tecnica può essere applicata per valutare i vaccini basati su cellule T positive per CD8 e altre interazioni tra patogeni non virali e ospite durante l'esecuzione di questa procedura.

È importante mantenere tutti i reagenti privi di RNA prima dell'ibridazione. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.