Incapsulamento cellulare in idrogel 3D per l'ingegneria tissutale

Il processo graduale di incapsulamento delle cellule inizia con la preparazione e la sterilizzazione degli stampi in idrogel e di altri materiali, seguita dall'isolamento delle cellule in popolazioni singole, distribuite in provette distinte per ogni serie di gel. Successivamente si effettua la polimerizzazione in presenza delle cellule, seguita dal periodo di incubazione in vitro o in vivo. L'analisi successiva del comportamento cellulare può includere test sulla vitalità, la morfologia, la proliferazione e la differenziazione.

Ciao, sono Amidio Kahan del laboratorio del Dott. Jason Burdick del Dipartimento di Bioingegneria dell'Università della Pennsylvania. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'incapsulamento cellulare in idrogeli 3D per l'ingegneria tissutale. Utilizziamo questo procedimento per studiare gli effetti della composizione e della struttura dell'idrogel sul comportamento delle cellule incapsulate.

Cominciamo. Per iniziare questa procedura, preparare una soluzione al 0,5% in peso del fotoiniziante air cure 2 9 5 9 o I 2 9 5 9 in PBS. Mescolare e incubare per due o tre giorni al buio a 37 gradi Celsius.

Quando pronto, utilizzare un filtro per siringa per sterilizzare la soluzione e conservarla a temperatura ambiente. Successivamente, utilizzare un programma per fogli di calcolo come Microsoft Excel per calcolare la quantità di polimero e di crosslinker necessaria, come illustrato. Ecco acido ialuronico funzionalizzato con gruppi reattivi acrilati.

Calcolare anche la quantità del peptide penant contenente il dominio adesivo funzionale con gli amminoacidi cisteina, arginina, glicina e aspartato. La cisteina serve per l'ancoraggio al polimero. Ora che sono state determinate le quantità necessarie di crosslinker polimerico e pent, pesarle e collocare ciascuna in un tubo einor.

Regolare il foglio di calcolo per il calcolo di conseguenza. Per la massa effettiva di polimero ottenuta, procedere a preparare gli stampi per gel. Utilizzare una lametta per rimuovere le punte dei singoli pacchetti sterili.

Siringhe monouso da un millilitro. Assicurarsi che il taglio sia piatto per gli stampi da utilizzare per il trasferimento del modello fotografico sui gel. Infine, sterilizzare gli stampi per siringa e i tubi EOR con i tappi aperti, insieme ad altri materiali necessari, posizionandoli sotto una sorgente luminosa germicida integrata nell'armadio di sicurezza biologica per 30 minuti.

Una volta completata la sterilizzazione, procedere a preparare le cellule dopo aver sterilizzato l'apparecchiatura sperimentale. Lavorare in cappa e aggiungere TEA sterile al polimero utilizzato nel reticolaggio di tipo mical e PBS sterile al polimero utilizzato per il reticolaggio a radicali liberi. Aggiungere il tampone corrispondente ai tubi contenenti i gruppi laterali e vortexare.

Per sciogliere il gruppo laterale che si lega all'acido ialuronico alchilato tramite una tiolo da un gruppo INE sul peptide per attaccare il gruppo laterale al polimero, aggiungerlo alla soluzione polimerica e sigillare con param. In breve, vortexare e incubare a 37 gradi Celsius con agitazione. Nel frattempo, mentre si preparano le cellule e il gruppo laterale si sta legando, preparare le cellule da incapsulare, come cellule staminali mesenchimali umane o HMC, lavandole con PBS.

Quindi incubare con tripsina per un minuto a temperatura ambiente, rimuovere la tripsina e incubare altri cinque minuti a 37 gradi. Aggiungere quindi il mezzo di crescita per HMSC per neutralizzare la tripsina e staccare le cellule dalla superficie della piastra. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.

Separare le cellule contate in porzioni contenenti il numero appropriato per ogni serie di gel. Per un insieme di tre gel da 50 microlitri a una densità di 10 milioni di cellule per millilitro, separare 1,5 milioni di cellule in una provetta conica individuale. Non preparare più di quattro gel in un singolo lotto a causa dei tempi di polimerizzazione.

Successivamente, centrifugare le cellule a 500 RCF per sei minuti. A temperatura ambiente, mentre le cellule sono in centrifugazione, preparare la miscela di polimerizzazione per il reticolaggio con mical edition. Aggiungere buffer al crosslinker per ottenere la concentrazione appropriata.

Per il reticolaggio radicalico avviato dalla luce, aggiungere la soluzione di I 2 9 5 9 precedentemente preparata alla soluzione polimerica. Al 10% del volume totale del gel da formare, per una concentrazione finale di iniziatore dello 0,05% in peso. A questo punto, le cellule e la miscela di polimerizzazione sono pronte per essere incapsulate nell'idrogel.

Iniziare aspirando lo snat dalle cellule centrifugate. Attendere che il liquido si depositi dopo l'aspirazione iniziale e aspirare nuovamente per rimuovere la maggior quantità possibile di mezzo senza disturbare il pellet cellulare Resus. Sospendere il pellet cellulare con la soluzione polimerica per evitare bolle d'aria.

Pipettare lentamente la soluzione su e giù circa 10 volte, il che dovrebbe essere sufficiente per distribuire le cellule in modo uniforme. Per la reazione di aggiunta di tipo mical, utilizzare una punta di pipetta con orifizio largo per aggiungere il volume appropriato di soluzione del crosslinker alla cellula polimerica. Mescolare. Impostare la pipetta sul volume individuale desiderato del gel.

Pipettare la soluzione su e giù per omogeneizzarla ed Eloqua negli stampi della punta della siringa. Eseguire rapidamente questo passaggio per garantire una distribuzione uniforme delle cellule e lasciare incubare da 10 a 30 minuti nel cabinet di coltura per il reticolaggio. Per il reticolaggio radicalico libero iniziato dalla luce.

Aliquotare il volume appropriato in stampi per punte di siringa. Esporre le siringhe alla luce UV per l'incrocio radicalico con un'esposizione di 10 minuti a 365 nanometri. Una luce UV di 4 milliwatt per centimetro quadrato è comune per polimeri funzionalizzati con ACRL.

Eseguire rapidamente il passaggio per minimizzare l'aggregazione cellulare prima dell'esposizione alla luce UV. Dopo il cross-linking, immergere i gel nei pozzetti di una piastra per colture cellulari contenente mezzo di coltura, per l'incubazione e l'analisi. Il cross-linking dell'idrogel può anche essere eseguito in modo sequenziale.

Per prima cosa, aggiungere il colorante funzionalizzato metolato rumina a una concentrazione finale di 20 nanomolari nel gel. Il colorante aiuta a visualizzare il patterning poiché si incorpora preferenzialmente nelle regioni del gel reticolate in modo radicale. Successivamente, iniziare la reazione di polimerizzazione di tipo mic, ottenendo una frazione dei reticolanti teorici previsti per i passaggi seguenti.

Per la reticolazione mediata da radicali liberi, sarà necessario utilizzare una maschera progettata con un programma come Adobe Photoshop o Illustrator e stampata direttamente su maschere trasparenti. Le dimensioni della maschera devono corrispondere alla parte superiore rotonda della siringa. Utilizzare pinzette sterili per applicare una maschera sterile direttamente sulla superficie del gel ed esporre alla luce per reticolare il gel.

Qui sono inoltre mostrati HMC all'interno di idrogeli a base di HA un'ora dopo l'incapsulamento. Poiché gli idrogeli sintetizzati sono tipicamente trasparenti, le cellule possono essere visualizzate per la loro morfologia mediante microscopia ottica. Le stesse cellule sono state analizzate per la vitalità a 24 ore dall'incapsulamento utilizzando un kit fluorescente per la colorazione di cellule vive e morte.

Abbiamo utilizzato il calcio M per rilevare le cellule vive e l'omodimero di atherium per le cellule morte, osservando una vitalità superiore al 95%. Abbiamo inoltre utilizzato il saggio alamar blue per determinare il livello di proliferazione cellulare, misurato in base alla capacità delle cellule di metabolizzare il reagente del saggio, con conseguente cambiamento di colore. La colorazione cellulare è stata eseguita su H HMC a sette giorni dalla loro incapsulazione in un idrogel a base di HA degradabile e adesivo, seguendo procedure standard di fissazione e permeabilizzazione.

L'actina cellulare è visibile mediante etichettatura con fluoresceina di phalloidina e i nuclei sono contrastati con DAPI. L'immunomarcatura contro la cullina viene utilizzata per la visualizzazione delle adesioni focali all'interno della matrice di idrogel. La colorazione istologica è eseguita dopo disidratazione, inclusione in paraffina e sezionamento degli idrogel seguendo protocolli standard, su idrogel di acido ialuronico con HMSC inglobate ottenute per polimerizzazione radicalica.

Dopo una settimana di coltura, sono state colorate con ematossilina per evidenziare i nuclei e con ASIN per marcare il tessuto connettivo A, oltre a colorazioni blu per i glicosaminoglicani. La PCR in tempo reale viene utilizzata per quantificare la differenziazione delle cellule staminali incapsulate. Dopo aver sottratto il fondo, il livello di espressione di un gene di interesse è determinato dal numero di cicli in cui è stata raggiunta la fluorescenza soglia, rispetto a un segnale di riferimento passivo, costituito da un gene di mantenimento costitutivamente attivo. Abbiamo quindi appena mostrato come incapsulare cellule in idrogeli 3D e studiare il comportamento delle cellule nei gel.

Quando si utilizzano queste procedure, è importante garantire la completa sterilità dei materiali, mantenendo a lungo termine soluzioni tampone e reagenti sterili oppure sterilizzando con la lampada germicida a raggi UV. È tutto. Grazie per aver prestato attenzione alle procedure di lavaggio e buona fortuna con i vostri esperimenti.