Ingegneria Cell-permeabile proteine

La manipolazione della funzione cellulare può essere ottenuta attraverso gli approcci classici di trasfezione del DNA o di trasduzione virale negli ultimi 15 anni. Un altro metodo si è sviluppato. La proteina biologicamente attiva può essere direttamente consegnata nelle cellule di mammifero utilizzando piccoli peptidi fusi alla proteina di interesse, che ne promuove l'assorbimento cellulare.

Essendo utilizzato alcun DNA, si previene il rischio di agenesi da sforzo. A differenza dei metodi classici sopra menzionati, la trasduzione proteica consente il rilascio di proteine in modo titolabile.

Inoltre, è possibile modulare piccole popolazioni cellulari così come cellule non dividenti, come i neuroni post-mitotici. Per esprimere in modo efficiente una proteina ricombinante, si raccomanda l'utilizzo del sistema vettoriale Paciz. Si tratta di un sistema vettoriale modulare costituito da una variante terminale N e da una variante terminale C.

Entrambi i vettori permettono l'inserimento facile del gene di interesse ai fini della purificazione. È integrato un marcatore istidinico così come un dominio di trasduzione proteica. Nel nostro caso, il contatto con il virus HI favorisce l'assorbimento cellulare per la distribuzione cellulare.

Un segnale di localizzazione nucleare completa il vettore per motivi di controllo; i tag di fusione possono semplicemente essere rimossi. Inoltre, la disposizione di tali tag può avere un'influenza significativa sulle proprietà delle proteine di fusione. L'effetto su resa e purezza, così come su commercializzabilità e funzione biologica, non è prevedibile.

Ciao, mi chiamo Bernard Mus e lavoro nel gruppo di Ingegneria delle Cellule Staminali presso l'Istituto di Neurobiologia Ricostruttiva a Bonn, Germania. Ciao, mi chiamo Christoph P e sono anch'io membro del laboratorio Hoover. Il nostro gruppo sfrutta intensamente la tecnica di trasduzione proteica per consegnare direttamente proteine biologicamente attive in diverse cellule di mammifero, e oggi vogliamo guidarvi attraverso il processo di espressione e purificazione in e da e coli.

In seguito, desideriamo mostrarvi come applicare la proteina di fusione stabile nelle cellule in coltura per illustrare l'intera procedura di espressione, purificazione e applicazione. Utilizziamo la ricombinasi site-specifica Cree per modificare geneticamente le cellule staminali epidermiche murine. Ok. Ok. Cominciamo.

Per inoculare la coltura notturna, utilizziamo batteri già trasformati conservati in una stock di glicerolo a meno 80 gradi centigradi. Questi batteri contengono già il vettore che codifica per la ricombinazione decre. Utilizzando una punta di pipetta, preleviamo una piccola quantità di batteri sulla punta e la depositiamo nel becher contenente la coltura notturna.

La coltura notturna consiste in terreno LB integrato con glucosio a una concentrazione finale di 0,5% e 50 microgrammi di insulina carbonica per ml. Il becher viene quindi posto in un incubatore impostato a 37 gradi centigradi per l'espressione del Ricombinante Cree sito-specifico. Utilizziamo terreno TB pre-riscaldato per la coltura su larga scala finalizzata all'espressione.

Per accelerare l'espressione, si consiglia l'uso di terreno TB riscaldato a 37 gradi centigradi, che corrisponde alla temperatura durante l'espressione della proteina ricombinante. Successivamente, si aggiunge glucosio al terreno TB a una concentrazione finale di 0,5%. Il glucosio impedisce un aumento dell'espressione basale della proteina di fusione durante la crescita della coltura espressiva prima dell'induzione. Infine, l'ampicillina viene aggiunta alla coltura espressiva a una concentrazione finale di 100 microgrammi per ml per assicurare una coltura pura contenente solo batteri che possiedono ancora il plasmide che codifica per la proteina decree.

Ora possiamo prelevare la nostra coltura notturna e inoculare la coltura di espressione in un rapporto di uno a 50. I becher vengono quindi trasferiti in un incubatore impostato alla temperatura di 37 centigradi. Durante l'espressione, è necessario prelevare campioni a intervalli regolari per misurare la densità ottica.

Non appena la coltura ha raggiunto una densità ottica di 1,5, i batteri vengono indotti con una concentrazione finale di 0,5 millimolare di IPTG. Dopo un'ora di induzione, la coltura per l'espressione viene trasferita in provette e successivamente raccolta mediante centrifugazione. A tale scopo, utilizziamo un rotore SLA 3000.

La centrifuga gira a una velocità di 5.000 giri al minuto per 10 minuti a quattro gradi centigradi. Il soprannatante viene quindi scartato e il pellet batterico può essere conservato indefinitamente a meno 20 gradi centigradi. I pellet congelati vengono risospesi in buffer lizza, un volume pari a un litro di coltura di espressione.

Utilizziamo 10 ml di tampone lizza, attendendo circa 15 minuti fino a quando la soluzione diventa omogenea. Successivamente, si aggiunge un milligrammo di lisozima per ogni ml di sospensione. La soluzione viene mescolata per 20 minuti per consentire all'enzima di rompere i batteri.

Successivamente, viene aggiunto Benson Nase in una diluizione di uno a 1000 per ulteriori 15 minuti, il che taglierà il DNA producendo una soluzione non viscosa. Infine, si utilizza un sonicator per assicurare la lisi delle cellule. Il programma viene eseguito per un minuto e mezzo con una potenza del 45% al termine della certificazione.

Ricordare di prelevare un campione ad ogni passaggio, dal lisato grezzo all'analisi SDS-PAGE della purificazione. A questo punto è molto importante aggiungere un ml di tampone TSB ghiacciato per ogni ml di sospensione, poiché la proteina DECry tenderà a precipitare all'interno del ceppo glicerolato. Se si decide di saltare questo passaggio, si mescola brevemente la soluzione e il lisato grezzo è ora pronto per la centrifugazione.

A tal fine, utilizziamo un rotore SS 34. La centrifuga funziona a 17.000 giri al minuto per 30 minuti a quattro gradi centigradi. Al termine, il soprannatante S viene trasferito con attenzione in provette Falcon da 50 ml fresche.

Ora aggiungere la sospensione di nickel anti A al sopranatante contenente nickel. Anti A è un reagente fondamentale per la corretta purificazione delle proteine di fusione con il poliistidina. L'istidina forma un complesso con gli ioni nickel, consentendo la purificazione per affinità; ora agitare delicatamente i tubi in incubazione per 60 minuti a 40 gradi centigradi.

Dopo un'ora, è ora possibile applicare la sospensione su colonne da 20 ML e lasciare che la soluzione passi per gravità. Per produzioni su larga scala, è possibile suddividere la sospensione su diverse colonne. Successivamente, si lava la colonna due volte con un buffer contenente 15 millimoli di innersole.

La quantità di tampone utilizzata dipende dal volume della resina. Due MLS di nichel NTA corrispondono a un ml di resina ai fini del lavaggio. Dopo aver lavato, applichiamo cinque volumi della resina di tampone di lavaggio sulla colonna; a questo punto siamo pronti ad eluire la nostra proteina.

Pertanto, utilizziamo un buffer di eluizione con una concentrazione di 250 millimolar di immuno. Osservare come il colore della resina diventa verde. A causa delle elevate concentrazioni di proteina CRE, la frazione OID a volte diventa torbida.

Per evitare ciò, mescolare la soluzione e aggiungere ulteriore tampone di lisi; ora tutte le frazioni vengono raccolte e successivamente trasferite in un tubo per la lisi. La lisi rimuoverà l'ole; il primo passaggio di dialisi viene effettuato contro un tampone contenente una concentrazione elevata di sale. Dopo un'ora, il tampone ad alto contenuto salino viene sostituito e la procedura di dialisi prosegue per tutta la notte.

Il giorno successivo, il tubo da dialisi viene rimosso dal tampone ad alto contenuto salino e trasferito in un tampone contenente glicerolo. Dopo tre-cinque ore, il tampone con glicerolo viene sostituito e la dialisi viene nuovamente eseguita per tutta la notte. La lisi nel tampone con glicerolo produrrà una soluzione stock concentrata almeno di tre volte.

La soluzione madre può ora essere conservata a meno 20 gradi centigradi per diversi anni senza perdita di attività. Per l'assicurazione di qualità, è possibile caricare i campioni di SDS-PAGE raccolti su un gel e successivamente colorarlo. Per Kamasi, la proteina fusa Cree è rilevabile come una banda prominente nella frazione OID. Per utilizzare la concentrazione appropriata di ricombinazione Crew, si dovrebbe determinare la concentrazione mediante saggio di Redford.

Come applicare proteine stabili all'interno di cellule di mammifero. Innanzitutto, preparare le cellule bersaglio per ottenere le massime efficienze di trasduzione proteica. Osservare cellule in monocstrato alla densità che porterà a uno strato cellulare confluenziale all'80-90% nel giorno successivo, nel caso in cui le cellule bersaglio siano cellule YES, che crescono in colonie compatte.

Separare le cellule somatiche e ottenerle in sospensione singola cinque ore in anticipo. È importante preparare una sospensione di cellule singole prima della trasduzione proteica, perché altrimenti solo le cellule aeree sulla superficie di una colonia possono essere trasfuse. Aspirare il mezzo e lavare brevemente le cellule aeree con PPS prima del trattamento.

Rimuovere il mezzo Yes rimanente, contenente siero. Dopo aver aspirato le cellule con sovrapposizione di PPS con una pipetta e lasciarle incubare da tre a cinque minuti. A questo punto verificare al microscopio se tutte le colonie si sono disciolte in cellule singole.

Date le ragioni appena menzionate, questo è un passaggio cruciale per la trasduzione proteica nelle cellule yes. Trasferire le cellule staccate in un tubo. Posizionare il tubo su una centrifuga e centrifugare per raccogliere le cellule. Aspirare il sopranatante e risospendere le cellule.

P nei mezzi di crescita diluire le cellule in un numero appropriato di cellule. Questo ovviamente dipende dalle dimensioni della coltura tissutale. Incubare le cellule in piastra per ulteriori cinque ore.

Questo consentirà alle cellule aeree di avere tempo sufficiente per attaccarsi al fondo e crescere in modo aderente. La coltura madre di tre classi può essere conservata a meno 20 gradi per oltre due anni. Quando si lavora con proteine di fusione permanenti ricombinanti, è molto vantaggioso disporre di una soluzione madre che possa essere utilizzata su richiesta.

Mentre si attende che le cellule si attacchino alla piastra, è possibile preparare il mezzo di trasduzione C diluendo semplicemente un volume appropriato di proteina del ceppo permanente cellulare dal ceppo di colesterolo nel mezzo. Poiché la soluzione stock di Clare non è ancora sterile, il mezzo di trasduzione deve essere filtrato in condizioni sterili prima dell'uso. Si raccomanda di utilizzare una siringa che possa essere avvitata a un filtro per legame di proteine a lobi.

La concentrazione finale di creek dipende dal tipo di cellula o dai supplementi del mezzo. Ad esempio, il siero ha un forte effetto negativo sull'efficienza di trasduzione. Questo problema può essere superato utilizzando un mezzo privo di siero o aumentando la concentrazione di creek.

Troviamo la condizione ottimale che consente la massima efficienza di ricombinazione. Idratare la concentrazione del decreto a partire da 0,5 fino a 10 micromolari. Si consiglia di testare diversi tempi di incubazione compresi tra sei e 18 ore.

Dopo cinque ore di incubazione, prelevare le cellule bersaglio e aspirare il mezzo di coltura. Successivamente, sostituirlo con mezzo di trasduzione proteica e reinserire le cellule nell'incubatore per un'incubazione notturna. Lavare brevemente le cellule D con PPS e sostituire il mezzo di trasduzione proteica con mezzo ES normale.

48 ore dopo l'incubazione, l'espressione genica della cellula permanente Cree può essere rilevata mediante xul. Le cellule colorate con fenotipo bega positivo sono state ingegnerizzate con successo tramite ricombinazione specifica del sito. Cree il rapporto.

Le cellule ospitano la costruzione CRE-Lae mediante ricombinazione pre-indotta. Una sequenza di stop flanked da P viene escissa e un gene reporter luxe viene attivato sotto il controllo del promotore team. Al fine di valutare l'efficienza di ricombinazione in cellule aeree reporter pre-trattate, le cellule devono essere fissate.

Aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con PBS, quindi ricoprire le cellule con PFA al 4% e incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare nuovamente le cellule tre volte con PBS. Dopo aver aspirato il PBS dall'ultimo passaggio di lavaggio, aggiungere la soluzione di colorante Xal ai pozzetti e incubare le cellule tutta la notte a 37 gradi in un incubatore.

Il giorno successivo, l'attività di Beal può essere monitorata mediante cellule con collare blu. L'efficienza della ricombinazione può essere determinata dal numero di colonie blu. In condizioni ottimali, si dovrebbe essere in grado di raggiungere un'efficienza di ricombinazione superiore al 90%. Bene, oggi vi abbiamo mostrato come esprimere e purificare la ricombinazione specifica per sito da e coli.

In questo studio di prova di principio, siamo stati in grado di indurre la ricombinazione nella maggior parte dei sali. Ok, questo è tutto. Buona fortuna con i vostri Esperimenti.I.