Misurare coefficienti di diffusione via a due fotoni di recupero fluorescenza Dopo photobleaching
26 febbraio 2010
In questo articolo andremo a descrivere il procedimento per determinare coefficienti di diffusione multi-fotone con il recupero di fluorescenza dopo photobleaching. Inizieremo allineando il laser lungo il percorso ottico al campione e determinare i parametri corretti sperimentale, poi continuare a generare ed infine montaggio curve recupero fluorescenza.
La fluorescenza a multi fotoni. Il recupero dopo la procedura di fotobleaching è facilmente dimostrabile utilizzando un campione di molecole di colorante fluorescente in libera diffusione. Inizialmente, un fascio laser a bassa intensità viene inviato nel campione per generare un livello di riferimento di fluorescenza proveniente dalle molecole D all'interno del volume focale del laser.
Successivamente, un breve lampo di laser ad alta intensità viene inviato per fotobleccare una porzione delle molecole di colorante all'interno del volume focale. Infine, il fascio laser viene attenuato al livello di intensità bassa precedente e la fluorescenza viene monitorata mentre le molecole fotobleccate diffondono all'esterno e vengono sostituite da molecole ancora fluorescenti provenienti dall'esterno del volume focale. La curva risultante dell'intensità di fluorescenza in funzione del tempo viene analizzata per ricavare il coefficiente di diffusione.
Ciao, sono Kelly Sullivan del laboratorio di Edward Brown del Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università di Rochester. Oggi vi mostreremo come eseguire il recupero della fluorescenza a fotoni multipli dopo fotobleaching. Utilizziamo questa tecnica nel nostro laboratorio per studiare la diffusione in sistemi biologici sia in vitro che in vivo.
Iniziamo. Per cominciare, impostare la lunghezza d'onda del laser desiderata e inserire il filtro appropriato davanti al tubo fotomoltiplicatore o PMT. Successivamente, per evitare danni alla cellula pcal, regolare la potenza del laser a 200 milliwatt o inferiore.
Due specchi orientati a figura quattro si trovano a monte della cella pcal. Questi specchi sono necessari e sufficienti per allineare il fascio laser attraverso la cella pcal. Impostare l'offset di tensione sul controllore di polarizzazione della cella pcal a zero e regolare il percorso del laser attraverso la cella pcal in modo che il laser sia centrato rispetto alle finestre anteriore e posteriore.
Utilizzare lo specchio a monte nella figura quattro per centrare il fascio nella finestra anteriore e lo specchio a valle nella figura quattro per centrare il fascio nella finestra posteriore. Impostare ora la tensione attraverso il cristallo della cella pcal al valore massimo. Il valore appropriato dipende dalle lunghezze d'onda ed è riportato nel manuale delle istruzioni della cella pcal.
Regolare gli specchi nella figura quattro a monte della cella pcal finché la potenza in uscita dalla cella pcal non è massimizzata. Ora commutare la tensione attraverso il cristallo a zero e regolare l'offset di tensione sul controllore di polarizzazione per minimizzare la potenza in uscita dalla cella pcal. Riportare la potenza del laser incidente sulla cella pcal al valore richiesto per l'esperimento.
Ora spostandosi sul microscopio, ottenere un buon fuoco visivo su un campione fluorescente standardizzato. Qui stiamo utilizzando granuli di polline fluorescenti fissati. Una volta messo a fuoco, chiudere ermeticamente il microscopio e regolare la potenza del laser a un livello appropriato per l'acquisizione dell'immagine del campione modificando la tensione attraverso il cristallo della cella pcal.
Infine, spegnere le luci e accendere il PMT. Avviare una scansione ripetuta dell'immagine del campione standardizzato e regolare gli specchi a valle della cella pcal finché non si ottiene un'immagine nitida del campione. Ora esaminiamo come determinare le potenze sicure di monitoraggio per il fuoco all'interno del campione.
Per lo scopo di questo video, utilizzeremo un campione di colorante acquoso contenuto in una depressione di un vetrino e sigillato con un coprioggetto. Ridurre l'intensità del laser a una potenza bassa ma sufficiente per generare fluorescenza all'interno del campione. Sigillare il microscopio e deviare l'uscita dal PMT al contatore di fotoni.
Spegnere le luci, accendere il PMT e avviare una scansione puntuale sul software del microscopio. Impostare il contatore di fotoni in modo che integri su una scala temporale molto più lunga del tempo previsto di recupero della fluorescenza e registrare un numero ragionevole di punti dati. Aumentare la potenza ed acquisire un'altra serie di dati di conteggio dei fotoni.
Continuare ad aumentare la potenza fino a quando l'aumento del numero di fotoni sembra ridursi in modo significativo. Rispetto al grafico dell'aumento di potenza, il logaritmo del numero di fotoni in funzione del logaritmo della potenza. Qualsiasi deviazione da una pendenza pari a due indica un bleaching.
Durante il monitoraggio, selezionare una potenza di monitoraggio ragionevole al di sotto di questo valore di soglia. Ora determiniamo i parametri di ingresso per lo scalatore multicanale e il generatore di impulsi. Sul generatore di impulsi.
Impostare il tempo di pre-illuminazione pari a una-due volte superiore al tempo di recupero atteso e il tempo di sbiancamento pari a un decimo del tempo di recupero atteso sul dispositivo di regolazione. Impostare la larghezza del canale a circa metà della durata dello sbiancamento e impostare il numero di canali per registrazione in modo che il prodotto tra la larghezza del canale scelta e il numero di canali per registrazione sia maggiore del tempo di recupero completo atteso. Aggiungere i tempi di pre-sbiancamento e di sbiancamento e reinserirli nel generatore di impulsi, quindi impostare la frequenza della sequenza di pre-sbiancamento e sbiancamento su un valore appena inferiore all'inverso del prodotto tra la larghezza del canale e il numero di canali per registrazione.
Infine, impostare il numero di acquisizioni per scansione sullo scaler in base all'intensità del segnale al livello di potenza monitor scelto. Ora impostare la potenza monitor a un livello sicuro e la potenza di sbiancamento a circa 200 milliwatt al di sopra della soglia di sbiancamento determinata durante il test di sbiancamento monitor. Queste potenze vengono entrambe impostate come diverse tensioni attraverso il sigillo del cristallo della cella al, spegnere le luci del microscopio.
Accendere il PMT. Avviare una scansione puntuale sul software di imaging. Quindi avviare il generatore di impulsi e il scaler.
Per analizzare la curva di recupero risultante, indicare tre punti importanti: la fluorescenza prima della fotobleaching, la fluorescenza immediatamente successiva alla fotobleaching e la fluorescenza alla fine del set di dati. Utilizzare i valori di fluorescenza prima e immediatamente dopo la fotobleaching per stimare meglio il tempo di dimezzamento del recupero.
Ora, utilizzare le regole descritte nei passaggi precedenti per aggiornare i valori delle durate di pre-bleach e della finestra iniziale. Acquisire una nuova curva e continuare a regolare i parametri finché la curva risultante non mostri un chiaro effetto di bleach e un recupero regolare. Verificare la saturazione dell'eccitazione tracciando il logaritmo del parametro di profondità del bleach in funzione del logaritmo della potenza.
Ogni deviazione da una pendenza pari a due indica saturazione dell'eccitazione. Scegliere una potenza di sbiancamento che produca uno sbiancamento intenso ma che non causi saturazione. Infine, una volta determinati i parametri appropriati, continuare ad acquisire curve di recupero della fluorescenza dopo fotodistruzione a più fotoni o curve MP FP del campione di interesse.
Ora mostreremo risultati rappresentativi sia dei dati grezzi di MP FRAP sia della curva normalizzata di MP F wrapp che è stata adattata teel, il coefficiente di diffusione, i dati grezzi di MP F FRAP mostrano, un'intensa fotobleach e un recupero uniforme. Con il recupero completo che viene riportato per la seconda metà dei dati per adattare i dati. Normalizziamo innanzitutto il recupero rispetto alla fluorescenza media pre-bleach e quindi eseguiamo un adattamento ai minimi quadrati non lineare.
Rispetto al modello appropriato, entrambi i set di dati sono stati ottenuti in fluoresceina acquosa e forniscono coefficienti di diffusione. In accordo con la letteratura, vi abbiamo appena mostrato come eseguire un esperimento di recupero della fluorescenza a fotoni multipli dopo fotodegradazione.
Quando si esegue questa procedura, è importante prestare attenzione e impostare i parametri sperimentali, in particolare la durata della fotobleaching e le potenze di fotobleaching e monitoraggio, entro i limiti di sicurezza definiti nel protocollo. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta la procedura per la misurazione dei coefficienti di diffusione mediante il recupero della fluorescenza a fotone multiplo dopo fotobleaching. Il processo prevede l'allineamento del laser lungo il percorso ottico fino al campione e l'adattamento delle curve di recupero della fluorescenza.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microscopia a fluorescenza
- Misurazione della diffusione
- Tecniche di fotobelaching
Sfondo
- Il recupero della fluorescenza a fotoni multipli dopo fotobleaching è una tecnica utilizzata per studiare la diffusione molecolare.
- Il metodo fornisce informazioni sulle dinamiche delle molecole fluorescenti in un campione.
- Comprendere i coefficienti di diffusione è essenziale per varie applicazioni biologiche.
- La procedura è applicabile a campioni di molecole di colorante fluorescente che diffondono liberamente.
Scopo dello studio
- Illustrare la procedura per la misurazione dei coefficienti di diffusione.
- Fornire una metodologia dettagliata per i ricercatori del settore.
- Migliorare la comprensione della dinamica molecolare nei sistemi biologici.
Metodi Utilizzati
- Un fascio laser a bassa intensità genera un livello di fluorescenza di riferimento.
- Un lampo laser ad alta intensità fotodegrada una porzione delle molecole di colorante.
- La fluorescenza viene monitorata mentre le molecole fotodegradate diffondono e vengono sostituite.
- Le curve di recupero della fluorescenza vengono analizzate per ottenere i coefficienti di diffusione.
Risultati principali
- La procedura misura efficacemente i coefficienti di diffusione di molecole fluorescenti.
- Le curve di recupero della fluorescenza forniscono dati quantitativi sulla dinamica molecolare.
- Il metodo è riproducibile e può essere applicato a diversi tipi di campioni.
- I risultati contribuiscono alla comprensione delle interazioni molecolari in contesti biologici.
Conclusioni
- Il recupero della fluorescenza multifotonica dopo fotobleaching è una tecnica utile per misurare i coefficienti di diffusione.
- La metodologia descritta può essere utilizzata dai ricercatori per studiare la dinamica molecolare.
- Ulteriori applicazioni di questa tecnica possono migliorare la nostra comprensione dei processi biologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione dei coefficienti di diffusione mediante il recupero della fluorescenza a due fotoni dopo fotobleaching fornisce informazioni quantitative sulle dinamiche molecolari nei sistemi biologici, supportando la validazione degli bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici nella fase iniziale della scoperta. La tecnica consente una valutazione riproducibile e senza marcatura del trasporto di macromolecole, fornendo indicazioni per lo sviluppo di saggi e una maggiore affidabilità predittiva nei flussi di lavoro per l'identificazione dei composti promettenti. La sua applicabilità sia a sistemi in vitro che in vivo migliora la continuità traslazionale e riduce l'incertezza biologica nelle decisioni precliniche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche quantificando il comportamento diffusivo di macromolecole in sistemi pertinenti alle malattie.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico mediante la misurazione diretta della mobilità molecolare in ambienti naturali o ingegnerizzati.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio fornendo metriche basate sulla diffusione che si correlano con l'interazione con il bersaglio e la cinetica di legame.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per schermature successive, stabilendo parametri di diffusione di base.
- Riproducibilità: Fornisce letture quantitative basate sulla fluorescenza che supportano la standardizzazione del saggio tra diverse prove e laboratori.
- Scalabilità: Si integra con piattaforme automatizzate come LabVIEW per aumentare la produttività nelle campagne di screening di composti promettenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Si applica a sistemi biologici in vivo, consentendo la valutazione della diffusione in ambienti simili ai tessuti.
- Continuità traslazionale: Collega le fasi di scoperta e preclinica fornendo letture biophysiche coerenti tra diversi sistemi modello.
- Avanzamento basato sul rischio: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione quantificando le proprietà di trasporto molecolare che influenzano la distribuzione del farmaco e l'accesso al bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio all'identificazione del composto leader fino alla valutazione preclinica, fornendo dati biophysici che guidano la progettazione e l'ottimizzazione molecolare.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi misurando come la diffusione delle macromolecole cambia in diverse condizioni sperimentali, chiarificando il comportamento di percorsi e bersagli.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso misurazioni standardizzate del recupero della fluorescenza che garantiscono una valutazione coerente dei composti.
- Analisi: Genera coefficienti di diffusione quantitativi mediante l'adattamento ai minimi quadrati delle curve di recupero, consentendo il confronto oggettivo di varianti molecolari.
- Ricerca Translazionale: Si collega alla continuità preclinica permettendo misurazioni di diffusione sia in sistemi in vitro che in vivo, supportando l'estrapolazione su diverse scale.
- Riutilizzo Aziendale: Funziona come una piattaforma biophysica riutilizzabile per valutare la dinamica molecolare in progetti multipli e classi di bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica riguardo alla mobilità molecolare e alle interazioni.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso parametri laser definiti, protocolli di sbiancamento e acquisizione automatica dei dati.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'eliminazione precoce dei rischi associati agli obiettivi sulla base di profili biofisici derivati dalla diffusione.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto ai rischi identificando obiettivi con caratteristiche favorevoli di trasporto molecolare per lo sviluppo successivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a due fotoni, tecniche di fotobelaching e quantificazione della fluorescenza.
- È fortemente dipendente da strumentazione specifica, tra cui laser a impulsi, celle di Pockels, contatori di fotoni e sistemi di scansione compatibili.
- Necessita di standardizzazione dei parametri come potenza del laser, durata del belaching e ampiezza delle finestre di acquisizione tra diversi utenti e sedi.
- Comporta considerazioni di adattamento nel passaggio da modelli con coloranti in soluzione acquosa a campioni biologici complessi come cellule o tessuti.
- È limitata dalla necessità di etichettatura fluorescente o di fluorescenza intrinseca, che potrebbe richiedere un'ottimizzazione specifica per bersagli a bassa abbondanza.
