Visualizzazione RNA localizzazione in Xenopus Gli oociti
14 gennaio 2010
Visualizzazione di In vivo RNA di trasporto si ottiene microiniezione di fluorescente trascrizioni di RNA in Xenopus Ovociti, seguito dalla microscopia confocale.
In questo procedimento, l'RNA marcato con fluorocromo. I trascritti vengono iniettati nelle cellule XUS e la loro localizzazione viene monitorata. In primo luogo, l'RNA viene marcato con nucleotidi fluorescenti.
In una reazione di trascrizione in vitro, l'RNA viene quindi caricato in un apparato di microiniezione. Gli oociti vengono posizionati su una piastra per iniezioni e microiniettati con attenzione. Infine, gli oociti vengono coltivati per permettere la localizzazione dell'RNA prima dell'analisi mediante microscopia confocale.
Ciao, sono James Gagnan del laboratorio della dottoressa Kimberly Mallory presso il Dipartimento di Biologia Molecolare, Biologia Cellulare e Biochimica della Brown University. Oggi vi mostreremo un procedimento per visualizzare la localizzazione subcellulare dell'RNA negli oociti di Xap. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare l'architettura dell'RNA e i fattori proteici necessari per la localizzazione dell'RNA durante lo sviluppo vertebrale precoce.
Iniziamo. Per iniziare questa procedura, trascrivere l'mRNA, marcato sia radioattivamente che fluorescentemente come descritto nel protocollo scritto allegato. Aggiungere DS per degradare il DNA stampo, quindi arrestare la reazione aggiungendo EDTA.
Rimuovere i nucleotidi non incorporati e altre molecole piccole centrifugando attraverso una colonna G 50. L'RNA viene quindi concentrato mediante precipitazione con etanolo, lavato e risospeso. Dopo aver determinato la concentrazione mediante conteggio con scintillazione, diluire l'RNA a 50 nanomolari e conservarlo in aliquote da cinque microlitri a meno 80 gradi Celsius.
Quando si è pronti per eseguire la microiniezione, scongelare un Eloqua dell'RNA marcato e denaturare a 70 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, centrifugare per 10 minuti alla velocità massima in una microcentrifuga a temperatura ambiente per rimuovere le particelle e mantenere in ghiaccio. Poi, isolare i citi tagliando pezzi di ovaio xap post lavu in un conico da 50 millilitri contenente 25 millilitri di tre milligrammi per millilitro.
Collagenasi in un tampone di fosfato di potassio 0,1 M a pH 7,4. Agitare delicatamente a 18 gradi Celsius a causa della variabilità tra diversi lotti. Il tempo di trattamento con collagenasi può variare e deve essere monitorato attentamente mediante ispezione visiva.
Per assicurare la defollicolazione, continuare ad agitare per 15 minuti o fino a quando gli oociti sono visibilmente separati dall'ovaio, quindi lasciare sedimentare gli oociti sul fondo del tubo conico. Rimuovere la soluzione e sostituirla con buffer MBSH. Ripetere questa operazione, eseguendo altre due lavature per un totale di tre lavaggi.
Successivamente, eseguire manualmente la selezione delle cisti di stadio tre e quattro in tampone MBSH utilizzando un microscopio ottico standard. Le cisti di stadio tre sono completamente opache, ma di colore bianco. Le cisti di stadio quattro sono leggermente più grandi e punteggiate di pigmento.
Le cellule che sono leggermente trasparenti sono troppo giovani, mentre quelle completamente pigmentate o che mostrano una distribuzione polarizzata del pigmento sono troppo vecchie. Infine, preparare gli aghi per la microiniezione utilizzando capillari da tre pollici e mezzo, tirandoli e affilandoli per ottenere aghi con un diametro esterno di circa 0,05 millimetri. Ora che gli oociti con mRNA e gli aghi sono pronti, procedere con la microiniezione.
Iniziare calibrando l'ago con acqua desy per somministrare due nanometri per iniezione. Caricare l'ago utilizzando un microiniettore a controllo gassoso e calibrare la dimensione della goccia usando un micrometro. Dopo la calibrazione, caricare in avanti l'RNA da iniettare nell'ago. Successivamente, posizionare gli oociti ordinati in una piastra per iniezioni contenente buffer MBSH; la piastra contiene uno strato di gomma schiuma nera.
Il citoplasma bianco risalta bene su uno sfondo nero. Quindi iniettare con attenzione ciascun oocita con due litri di RNA a 50 nanomolar. Assicurarsi di iniettare ogni oocita una sola volta e controllare regolarmente l'ago per eventuali ostruzioni al termine dell'iniezione.
Espellere l'RNA rimanente, risciacquare l'ago con acqua deionizzata e caricare l'RNA successivo per l'iniezione. Dopo l'iniezione, trasferire i citi iniettati in una pozzetta di una piastra sterile a 24 pozzette, fino a un migliaio. I CITI possono essere coltivati per pozzetta.
Rimuovere il buffer e sostituirlo con 400 microlitri di mezzo di coltura cellulare per pozzetto. Successivamente, posizionare la piastra di coltura all'interno di un contenitore di plastica con un tovagliolo di carta bagnato per mantenere un ambiente umido durante la coltura; incubare gli oociti a 18 gradi Celsius per intervalli di tempo compresi tra otto e 48 ore dopo il periodo di incubazione desiderato. Gli oociti possono essere preparati per la microscopia dopo l'incubazione degli oociti iniettati.
Separare le oociti morte e collocare le oociti sopravvissute in vial di vetro. Si osserva di routine una sopravvivenza superiore al 90% delle oociti. Sostituire il buffer con fissativo M-E-M-F-A e agitare delicatamente le cellule per 20 minuti.
Proteggere le ovociti dalla luce solare durante la fissazione, una volta completato il periodo di fissazione. Lavare le ovociti rimuovendo il fissativo e sostituendolo con un volume uguale di tampone MBSH. Ripetere questo lavaggio un'altra volta, per un totale di due lavaggi.
Successivamente, lavare gli oociti in metanolo anidro. Per prima cosa, rimuovere metà del volume e sostituirlo con metanolo. Ripetere questa operazione altre due volte.
Dopo questi lavaggi, rimuovere tutta la soluzione e sostituirla con metanolo. Ripetere questo lavaggio con metanolo un'altra volta. Gli ovociti fissati e disidratati possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'acquisizione delle immagini.
Prima dell'acquisizione delle immagini, aggiungere il mezzo di chiarificazione di Marie a una piastra fluoro WPI con fondo in vetro in modo da coprire la superficie di imaging. Trasferire con attenzione gli oociti dal metanolo alla piastra fluoro, minimizzando il volume di metanolo trasferito. Acquisire le immagini degli oociti mediante un microscopio confocale invertito; sia il Zeiss LSM five 10 che l'aica TCSs P forniscono buoni risultati. Ora mostreremo alcune immagini rappresentative della localizzazione subcellulare dell'RNA immediatamente dopo la microiniezione: l'RNA fluorescente può essere osservato nel nucleo dopo otto ore di coltura di un controllo marcato con fluorescenza.
L'RNA può essere osservato distribuito uniformemente nel citoplasma dell'ovocita. Tuttavia, un RNA marcatto con fluorescenza contenente sequenze in grado di reclutare il macchinario del trasporto può essere visto nel processo di localizzazione subcellulare al polo vegetale dell'ovocita. Abbiamo appena mostrato come iniettare mediante microiniezione RNA marcati con fluorescenza in ovociti e osservare la localizzazione dell'RNA mediante microscopia confocale.
Quando si esegue questa procedura, è importante utilizzare soluzioni trattate con DEPC per evitare contaminazioni da RNA nella coltura, mantenere le cellule in OCM contenente antibiotici e proteggere le cellule dalla luce solare ogni volta che possibile per evitare il fotoblecamento. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
In questo articolo viene descritta la visualizzazione del trasporto di RNA in vivo mediante trascritti di RNA marcati con fluorocromo iniettati in oociti di Xenopus. La localizzazione dell'RNA è monitorata mediante microscopia confocale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia dell'RNA
Sfondo
- Il trasporto dell'RNA è cruciale per diversi processi cellulari.
- Gli oociti di Xenopus costituiscono un sistema modello per lo studio della dinamica dell'RNA.
- La marcatura fluorescente permette la visualizzazione in tempo reale dell'RNA.
- La microscopia confocale offre capacità di imaging ad alta risoluzione.
Scopo dello studio
- Visualizzare il trasporto dell'RNA all'interno di cellule vive.
- Comprendere i meccanismi di localizzazione dell'RNA.
- Utilizzare un metodo affidabile per lo studio della dinamica dell'RNA negli oociti.
Metodi Utilizzati
- Etichettatura fluorescente dei trascritti di RNA mediante nucleotidi.
- Microiniezione di RNA in oociti di Xenopus.
- Coltura degli oociti per consentire la localizzazione dell'RNA.
- Acquisizione di immagini mediante microscopia confocale per monitorare il trasporto dell'RNA.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita del trasporto dell'RNA negli oociti.
- Dimostrazione dell'efficacia della marcatura fluorescente.
- Informazioni sui modelli di localizzazione dell'RNA.
- Convalida della microscopia confocale come strumento per lo studio dell'RNA.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un approccio potente per lo studio della dinamica dell'RNA.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei meccanismi di trasporto dell'RNA.
- Studi futuri possono basarsi su questa metodologia per ottenere ulteriori approfondimenti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La visualizzazione della localizzazione dell'RNA negli oociti di Xenopus permette un'analisi diretta dei meccanismi di trasporto dell'RNA, sostenendo la scoperta precoce e la validazione di bersagli nella biologia della polarità cellulare e dello sviluppo. Questo approccio basato sull'immagine fornisce un'elevata affidabilità predittiva per studi funzionali di elementi cis- e trans-attivatori, guidando decisioni ponderate sui rischi nello sviluppo di modelli preclinici. I risultati quantitativi e riproducibili del metodo facilitano la selezione del portafoglio e la riduzione dei rischi meccanicistici per strategie terapeutiche mirate all'RNA.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette la visualizzazione diretta della localizzazione dell'RNA per chiarire i percorsi di trasporto e i determinanti molecolari.
- Consente la validazione funzionale di elementi di sequenza e fattori proteici coinvolti nel traffico dell'RNA.
- Fornisce una riduzione del rischio meccanicistica distinguendo eventi di localizzazione specifici da quelli non specifici.
- Facilita l'analisi guidata da ipotesi sulle interazioni RNA-proteina rilevanti per la polarità cellulare.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce un saggio di imaging validato per la quantificazione dei modelli di localizzazione dell'RNA in cellule vive.
- Supporta la standardizzazione e la riproducibilità attraverso protocolli controllati di microiniezione e di imaging.
- Permette la scalabilità per lo screening degli effetti di molecole candidate o di perturbazioni genetiche sul trasporto dell'RNA.
- Fornisce letture quantitative adatte per analisi comparative tra diverse condizioni sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a sistemi rilevanti per le malattie modellando difetti del localizzamento dell'RNA implicati nei disturbi dello sviluppo.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, permettendo studi meccanicistici in un modello vertebrale.
- Supporta un avanzamento basato sulla valutazione del rischio collegando meccanismi molecolari a esiti fenotipici negli ovociti.
- Offre un valore predittivo per l'identificazione di biomarcatori traslazionali in base alla dinamica del localizzamento dell'RNA.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa tecnica di imaging si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica permettendo la verifica di ipotesi, la validazione meccanicistica e l'analisi quantitativa della localizzazione dell'RNA in un sistema modello.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione del rischio biologico attraverso la visualizzazione diretta del trasporto dell'RNA.
- Screening: Fornisce prontezza e riproducibilità del saggio per valutare l'impatto di interventi molecolari sulla localizzazione dell'RNA.
- Analisi: Fornisce output di imaging quantitativi per confronti statistici robusti tra gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega informazioni meccanicistiche a fenotipi rilevanti per le malattie nello sviluppo vertebrale precoce.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per lo studio di diversi eventi di localizzazione dell'RNA e dei fattori regolatori.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla localizzazione dell'RNA.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi basati sull'immagine.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza del capitale fornendo letture funzionali solide.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata ai rischi dei programmi mirati all'RNA sulla base di dati meccanicistici validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microiniezione, imaging confocale e manipolazione dell'RNA.
- Necessita dell'accesso a reagenti per l'etichettatura fluorescente e a infrastrutture per microscopia ad alta risoluzione.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di iniezione e di imaging per garantire la riproducibilità.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse specie di RNA o sistemi modello, in base alla sequenza e ai meccanismi di trasporto.
- I limiti pratici includono la stabilità dell'RNA, il fotobiancamento e le limitazioni di throughput intrinseche alla microiniezione manuale.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:00
Title
0:30
Introduction
1:03
Preparing for Microinjection
3:14
Microinjection and Oocyte Culture
4:35
Fixation, Dehydration, and Storage of Oocytes
5:35
Imaging RNA Localization by Confocal Microscopy
5:59
RNA Localization in Xenopus Oocytes: Representative Results
6:28
Conclusion
