Mosaico Transgenesi Zebrafish per la valutazione sequenze Enhancer

Ciao, sono Erica Kgi del laboratorio di Shannon Fisher del Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo dell'Università della Pennsylvania. Sono Chris Weber, anch'io del Fisher Lab. E io sono Shannon Fisher.

Oggi vi mostreremo un procedimento per analizzare la funzione di elementi enhancer mediante trasgenesi nel pesce zebra. Utilizziamo questo procedimento per studiare la regolazione trascrizionale di geni importanti nello sviluppo scheletrico. Cominciamo dunque.

Per identificare le sequenze non codificanti che circondano geni candidati, utilizziamo l'algoritmo fast cons, disponibile come traccia sul browser del genoma uc SC. Siamo principalmente interessati ai geni espressi durante lo sviluppo scheletrico, ma lo stesso approccio può essere impiegato per studiare qualsiasi gene espresso nelle fasi iniziali dello sviluppo. Nell'esempio mostrato qui, abbiamo identificato sequenze conservate.

Nell'intervallo che circonda il gene bumper umano, esaminiamo l'intero tratto fino ai geni adiacenti e determiniamo una soglia di dimensione ridotta per il punteggio logaritmico specifico, corrispondente approssimativamente al 5% superiore delle sequenze non codificanti. Dopo aver selezionato le sequenze, progettare primer utilizzando Primer3 per amplificare ciascuna sequenza a partire dal DNA genomico umano; i primer devono essere scelti in modo da amplificare la regione conservata più altre 30 o più coppie di basi su ciascun lato. Amplificare la regione di interesse mediante una polimerasi di alta qualità utilizzando DNA genomico umano ed eseguire le normali procedure di biologia molecolare in laboratorio per clonare il prodotto amplificato in un vettore di espressione.

Il vettore utilizzato in questo protocollo è PG wc FOS GFPA gateway. Vettore di destinazione. Dopo la creazione del vettore, procedere al trasporto.

L'enzima necessario per la trasposizione viene inizialmente trascritto in vitro utilizzando il kit M message M machine di Ambion e il plasmide PGB 600 prima delle iniezioni sperimentali. Verificare l'efficacia di ogni lotto di trasposasi mediante iniezione con un enhancer noto, come ad esempio l'enhancer 10 del gene delle calze del topo.

Per prepararsi alle iniezioni, tirare le micropipette utilizzate per la microiniezione da vetro capillare con filamento esterno di 1,2 millimetri su un micropipettatore Sutter P 97. Utilizzare un programma che produca una punta resistente con un restringimento preciso, in grado di penetrare integumenti intatti, usando una lametta affilata e un vetrino graduato. Rompere manualmente le punte sotto un microscopio stereoscopico fino a ottenere un diametro esterno di circa 15 micrometri.

I campioni possono essere conservati per un giorno in una capsula coperta. Mantenere la popolazione di pesci zebra in un ciclo regolare chiaro-scuro con 14 ore di luce in condizioni standard il giorno precedente l'esecuzione delle microiniezioni. Preparare i pesci per accoppiamenti programmati in piccoli acquari di riproduzione.

Posizionare tre femmine o due maschi per vasca in file parallele al mattino delle microiniezioni, poco dopo l'inizio del ciclo luminoso. Combinare maschi e femmine in acqua trattata del sistema pulita per la produzione di uova. Controllare frequentemente i pesci e raccogliere le uova entro pochi minuti dalla deposizione per ottenere lotti ben sincronizzati.

Mantenere la produzione di uova per due o tre ore continuando ad accoppiare nuovi gruppi di pesci durante tutta la mattinata, utilizzando una pipetta di vetro larga cinque pollici e un quarto dotata di un bulbo in lattice. Suddividere gli embrioni raccolti in piatti di Petri da 60 per 15 millimetri, parzialmente riempiti con mezzo per embrioni, in gruppi di 50 embrioni. Riportare sull'etichetta di ciascun coperchio l'orario di raccolta.

Per ogni covata di embrioni raccolti, conservare una piastra con 50 embrioni come controllo non iniettato tra una raccolta e l'altra. Preparare soluzioni di iniezione fresche mescolando i seguenti ingredienti in un tubo da microcentrifuga e conservarle sul ghiaccio. Posizionare gli aghi di iniezione in piastre portaaghi e riempirli con 1,5-2 microlitri di soluzione di iniezione.

Pipettando gocce di 500 nanolitri sull'estremità larga di ciascun ago. Il liquido verrà aspirato verso la punta attraverso l'azione capillare. Preparare almeno due aghi per ogni soluzione di iniezione.

Inserire l'ago riempito nel supporto manuale dell'ago di una pompa pneumatica pico o di un iniettore a pressione simile, configurato e collegato a una bombola di azoto seguendo le istruzioni del produttore. Calibrare i volumi di iniezione misurando il diametro delle goccioline espulse nell'olio minerale su un vetrino micrometrico, tipicamente con un tempo di iniezione di 120 millisecondi.

Con una pressione di 20 PS, otterrò una goccia di circa un nanolitro utilizzando un microscopio stereoscopico con un ingrandimento compreso tra 6 e 10 volte. Tenere fermo l'embrione con un paro di pinzette fini e spingere l'ago di iniezione con pressione costante attraverso la coriona fino al tuorlo di un embrione allo stadio a una cellula o a due cellule iniziale, posizionando la punta dell'ago nel tuorlo appena al di sotto dei blastomeri; espellere circa un nanolitro di soluzione di iniezione e quindi ritirare l'ago. Per ogni costrutto, iniettiamo un numero maggiore o uguale a 200 embrioni. Al termine delle iniezioni, selezionare gli embrioni rimuovendo le uova non fecondate, gli embrioni danneggiati, le iniezioni fallite o gli embrioni privi di rosso fenolo nei blastomeri.

Successivamente, incubiamo gli embrioni e il mezzo embrionale a 28,5 gradi Celsius fino al momento appropriato per le osservazioni. Ora vi mostreremo alcuni risultati rappresentativi di elementi enhancer che producono schemi specifici di tessuto nell'espressione di GFP nell'embrione di pesce zebra. Studiamo geni espressi nell'osso o nella cartilagine durante.

Ecco un esempio di elemento enhancer a monte del gene acan che regola l'espressione nella cartilagine craniofacciale a tre giorni dalla fecondazione. Ecco un altro enhancer, questa volta del gene bumper, che regola l'espressione nelle cellule ossee. A cinque giorni, tra i numerosi enhancer che abbiamo identificato, osserviamo una scarsa correlazione tra la posizione rispetto al gene e la regolazione dell'espressione.

Quando si scelgono le sequenze da testare, è importante ricordare che un enhancer può trovarsi a centinaia di chilobasi a monte o a valle di un gene oppure all'interno di uno degli introni, come osservato in questo embrione. Una parte consistente delle sequenze non sembra regolare l'espressione specifica per tessuto. Queste spesso mostrano una fluorescenza molto debole o possono presentare alcune cellule isolate in due siti comuni per l'espressione ectopica: l'epidermide e il muscolo scheletrico.

Abbiamo appena mostrato come identificare elementi potenziatori potenziali attraverso la conservazione della sequenza e testarne la funzione mediante trasgenesi mosaicale nel pesce zebra. Quando si esegue questa procedura, è importante esaminare attentamente la qualità del DNA e dell'RNA utilizzati per le iniezioni. Inoltre, assicurarsi di esaminare con cura tutti gli embrioni iniettati, specialmente se ci si aspetta un'espressione solo in un piccolo gruppo di cellule.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.