Multicolor Citometria a Flusso di analisi Cellular risposta immunitaria in macachi Rhesus

In questo video viene illustrata una procedura per stimolare e colorare le cellule mononucleate del sangue periferico o pbmc. Per l'analisi mediante citometria a flusso multicolore, Alec Watts di pbmc isolate dal sangue intero vengono poste in piastre per colture cellulari. Le cellule vengono stimolate chimicamente o biologicamente per indurre una risposta immunitaria.

Dopo la stimolazione, viene aggiunta una miscela di anticorpi per identificare i tipi cellulari in base ai marcatori di superficie espressi. Le cellule vengono quindi permeabilizzate e aggiunta una diversa miscela di anticorpi per rilevare l'espressione di citochine intracellulari; successivamente, le cellule vengono analizzate mediante FACS per determinare i profili di citochine per specifici sottoinsiemi di PBMC. Ciao, sono Amy Courtney del laboratorio del Dottor Jagan SAS del Dipartimento di Immunologia presso il M.D. Anderson Cancer Center dell'Università del Texas.

Ciao, sono Hong, anch'io del laboratorio. Oggi vi mostreremo un'analisi di citometria multiparametrica delle risposte dei linfociti T. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le risposte immunitarie cellulari in Reus Maca.

Iniziamo. Iniziare questo protocollo utilizzando un emocitometro per determinare il conteggio delle cellule vitali di pbmc provenienti da Reuss Maca mediante il metodo di esclusione del colorante Trian Blue. Eseguire le operazioni in una cappa a flusso laminare reus.

Sospendere le cellule in mezzo completo a una concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro per la stimolazione non specifica, aggiungendo 100 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di mezzo contenente PMA e CIN per portare il volume totale a 0,2 millilitri, ottenendo una concentrazione finale di 50 nanogrammi per millilitro di PMA e 500 nanogrammi per millilitro di CIN; per i pozzetti di controllo negativo, aggiungere invece 100 microlitri di mezzo completo senza aggiunte. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in atmosfera umidificata con 5% di anidride carbonica dopo 1,5 ore.

Aggiungere la feldenina A alla coltura a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e incubare per ulteriori 4,5 ore. La feldenina A viene aggiunta per trattenere le citochine nell'apparato gold G al fine di aumentarne la visibilità mediante colorazione immunoistochimica; dopo la stimolazione, centrifugare per rimuovere il mezzo, quindi lavare aggiungendo 200 microlitri di buffer di lavaggio a freddo per la citofluorimetria e centrifugare a bassa velocità. Ripetere questo lavaggio, quindi risospendere in 50 microlitri di buffer di lavaggio per la citofluorimetria.

Le cellule sono ora pronte per essere colorate per l'espressione di marcatori di superficie in ciascun pozzetto delle cellule risospese. Aggiungere un microlitro di colorante fluorescente vitale morto fissabile di colore azzurro, preparato secondo le istruzioni del produttore e di S. Incubare a quattro gradi Celsius al buio per 30 minuti mentre le cellule sono in incubazione.

Preparare le soluzioni di marcatura che verranno utilizzate per le analisi in microtubi. In primo luogo, preparare un cocktail di partenza contenente i seguenti componenti in modo appropriato: anticorpi monoclonali marcati con fluorescenza titrati, anti CD3 PE SCI7, anti CD8 Alexa 700, anti CD28 PerCP SCI5.5, anti CD95 APC e anti CD4 Pacific Blue in Flusso Wash Buffer.

Successivamente, preparare i controlli di compensazione, che verranno utilizzati per determinare i coefficienti di spillover di ciascuna singola colorazione negli altri rilevatori, preparando un tubo per ogni anticorpo coniugato fluorescentemente come colorazione monocromatica. Infine, preparare le colorazioni con fluorescenza meno uno o FMO combinando tutti i reagenti tranne quello di interesse. Questa sarà utilizzata per determinare il limite tra una popolazione positiva e negativa, riproducendo i livelli di autofluorescenza e i dati presenti nei campioni completamente colorati.

Dopo che le cellule sono state incubate nel colorante live dead, lavarle una volta con tampone di lavaggio freddo per rimuovere l'eccesso di colorante, quindi aspirare il tampone di lavaggio. Aggiungere poi le soluzioni di colorazione preparate. Incubare le cellule a quattro gradi Celsius al buio per 30 minuti.

Lavare le cellule colorate con tampone di lavaggio freddo per citofluorimetria per rimuovere l'eccesso di anticorpo. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di fissazione e permeabilizzazione BD per almeno 10 minuti. Conservare le cellule a quattro gradi Celsius al buio fino a 24 ore, fino al momento dell'utilizzo, oppure procedere con l'etichettatura delle citochine intracellulari.

Permeabilizzare innanzitutto le cellule in 100 microlitri di perm 1X. Lavare il tampone e incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius al buio mentre le cellule sono in incubazione. Preparare gli anticorpi per la colorazione, i controlli di compensazione e i controlli FMO nel tampone di lavaggio 1X come in precedenza.

Dopo aver incubato le cellule per 10 minuti, centrifugare e rimuovere il buffer di lavaggio one x perm. Aggiungere gli anticorpi di marcatura appropriati. Quindi incubare le cellule e gli anticorpi per 60 minuti a quattro gradi Celsius al buio, successivamente all'incubazione.

Lavare le cellule due volte con la soluzione di permeabilizzazione. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in paraformaldeide al 1% in DPBS per fissare le cellule. Conservare le cellule a quattro gradi Celsius al buio fino al loro utilizzo entro 24 ore.

Dopo aver colorato le cellule, utilizzare un citofluorimetro LSR due o un citofluorimetro Cyan ADP per eseguire le analisi. Quindi analizzare i dati utilizzando FlowJo o software simili. La composizione dei PBMC in reuss Maca è stata determinata mediante analisi mediante fax.

Questa figura mostra lo schema di selezione utilizzato per l'analisi dei diversi sottoinsiemi di linfociti T provenienti da un animale rappresentativo. I linfociti sono stati innanzitutto selezionati mediante la diffusione della luce in avanti (FSC) rispetto alla diffusione laterale (SSC), quindi i linfociti vitali sono stati identificati in base alla popolazione negativa per SSC e AQUA. I linfociti T sono stati successivamente identificati tramite l'espressione di CD3; le popolazioni CD4 positivi, CD8 negativi e CD4 negativi CD8 positivi sono state determinate all'interno della popolazione di cellule T positive per CD3.

I linfociti T CD4 positivi e CD8 positivi sono stati ulteriormente suddivisi in diversi sottogruppi in base all'espressione di CD28 e CD95 come cellule naive, a memoria centrale e a memoria effettore. Questa figura mostra la produzione di interferone gamma e di IL-2 in linfociti T CD4 positivi non stimolati e stimolati con PMA/ionomicina e nei relativi sottogruppi.

Nota i profili citochinici distinti indotti dalla stimolazione. In ogni sottoinsieme. Dobbiamo mostrarti come eseguire l'analisi di citometria a flusso multiparametrica dei PBMC.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di impostare sia i controlli di compensazione monocromatici sia i controlli fluoroforo meno uno. Entrambi questi controlli sono necessari per un'analisi corretta dei dati di citometria a flusso. Si prega di consultare il nostro protocollo scritto per ulteriori informazioni sulla scelta dei controlli di compensazione.

Inoltre, ricordi che quando si utilizza un anticorpo marcato con fluorescenza, è importante coprire i campioni per proteggerli dall'esposizione alla luce. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i suoi esperimenti.