L'importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

L'obiettivo generale di questo articolo video è fornire risposte alle seguenti due domande. Primo, è possibile rendere più affidabili gli studi sulle interazioni proteiche misurando la frazione di un campione proteico che è effettivamente in grado di legarsi a un'altra proteina? Secondo, in che modo l'analisi cinetica può offrirci una comprensione migliore delle relazioni tra struttura e funzione?

Entrambe queste domande saranno affrontate in un esperimento che coinvolge Corp X 100, uno strumento che rileva le interazioni proteiche in tempo reale senza l'uso di marcatori. Questo esperimento esaminerà l'interazione della cistatina B bovina con la cistina proteasi papaina; la struttura cristallina delle due proteine in complesso indica diversi residui coinvolti nel legame con la proteasi, al fine di determinare come ciascuno dei residui interagenti influisce sull'interazione tra cistatina B e papaina. Diversi varianti della cistatina B sono prodotti mediante mutagenesi mirata.

In questi esperimenti, esiste sempre la possibilità che le proteine ricombinanti non si ripieghino correttamente, si aggreghino o degradino, portando a risultati errati e non riproducibili. VIACORE X 100 è in grado di determinare la frazione di proteina disponibile per il legame mediante l'analisi della concentrazione libera da calibrazione, abbreviata CFCA. Questo approccio consente di determinare la concentrazione di proteina con attività di legame conservata, anche in assenza di standard di calibrazione.

La CFCA verrà utilizzata qui per determinare la concentrazione delle varianti della cistatina B. Questi dati verranno poi utilizzati come input nella determinazione della cinetica di legame delle varianti della cistatina B con Pepin, che viene valutata anche mediante BOR X 100. Ciao, sono CLA gram di GE Healthcare in Svezia.

Oggi la mia collega Eva Pool vi mostrerà come eseguire l'analisi della relazione struttura-funzione utilizzando BOR X 100. Le proteine ricombinanti possono presentare un ripiegamento improprio o perdere attività di legame nel tempo, e questo comportamento non può essere rilevato da metodi basati sulla misurazione della concentrazione totale. Ciò può portare effettivamente a dati cinetici errati a seguito delle misurazioni di concentrazione mediante analisi di concentrazione libera da calibrazione. B.A core X 100 viene utilizzato per analizzare la cinetica e l'affinità dell'interazione tra varianti della cistatina B e la pepaina.

Questi parametri forniranno informazioni sul meccanismo di legame. Iniziamo con una breve spiegazione della progettazione sperimentale, quindi cominciamo. L'interazione tra la cistina, la proteasi, la papaina e l'inibitore cistatina B è dominata da contatti idrofobici, come rivelato dalla struttura cristallina delle due proteine in complesso.

Dal lato dell'inibitore, le aree di contatto sono i residui N-terminale e C-terminale e due loop a forcina. In questo studio vengono esaminati quattro mutanti, ognuno dei quali presenta una mutazione da cisteina a serina introdotta allo scopo di prevenire la dimerizzazione della cistatina B. Sulla base delle informazioni ottenute dalla struttura cristallina, la leucina 73 è stata mutata in glicina, l'istidina 75 in glicina e la tirosina 97 è stata sostituita con alanina. Le due mutazioni in glicina sono state introdotte per valutare l'importanza dei gruppi laterali dell'istidina 75 e della leucina 73 per il legame con la pepstatina; il residuo di tirosina è stato mutato in alanina per studiare l'interazione tra il dominio C-terminale della cistatina B e la pepstatina.

I tre mutanti doppi, così come il mutante singolo INE tre a Siriano, vengono testati per la loro interazione con una variante cataliticamente inattiva della papaia S-metil popina. Questa forma cataliticamente inattiva del Proteus presenta un gruppo metile legato al CYS 25 nella fessura attiva. Per semplicità, chiameremo questa variante propan per tutto il protocollo.

CFCA si basa sulla misurazione della velocità di legame in condizioni in cui la velocità è limitata dalla diffusione delle molecole dell'analita verso la superficie. Questo è favorito da elevati livelli di immobilizzazione del ligando. Prima di iniziare la procedura di immobilizzazione, posizionare il tampone HEPs utilizzato negli esperimenti sul vassoio sinistro e inserire entrambi i tubi.

Posizionare anche una bottiglia vuota per i rifiuti sul vassoio destro. Quindi inserire un nuovo sensore Gypsum Five nell'apparecchio, inizializzarlo tramite il software Core X 100 e, nella schermata iniziale, fare clic sull'elemento dello strumento "Dock Chip". Fare clic su "Start Doc" nel software.

Successivamente, utilizzare la procedura guidata di immobilizzazione per configurare il metodo e l'immobilizzazione, puntando il coupling al sensore CM5 a partire dalla schermata iniziale: fare clic sul pulsante altre opzioni, quindi selezionare procedure guidate. Verrà visualizzata una finestra con le procedure guidate disponibili. Selezionare immobilizzazione, quindi fare clic sul pulsante nuovo. In basso a destra, appare la prima schermata della procedura guidata di immobilizzazione: il coupling diretto al sensore CM5 è quello predefinito.

Selezionare la casella sotto la cella di flusso due per immobilizzare nella cella di flusso due. La cella di flusso uno viene lasciata invariata in modo da utilizzarla come superficie di riferimento tra le tre opzioni disponibili di seguito. Selezionare la casella specifica tempo di contatto: il livello target a destra cambia in tempo di contatto; specificare un tempo di contatto di 900 secondi.

Successivamente, inserire i parametri di immobilizzazione nella soluzione del legante molecolare di cattura. Inserire la papaina. Quindi fare clic su Avanti.

La schermata successiva mostra la disposizione del rack del campione. La posizione uno conterrà l'etanolammina utilizzata per disattivare i gruppi attivi residui dopo l'accoppiamento mirato del ligando papaina alla superficie del chip. Inserire la soluzione di etanolammina nella posizione uno al posto due.

Posizionare il ligando papaina, che viene conservato in eccesso di solfato di metile e diluito a 50 microgrammi per millilitro in tampone acetato di sodio 10 millimolare, a pH 4,5. Ricostruire i reagenti di accoppiamento EDC e NHS del kit per accoppiamento amminico con acqua bidistillata; pipettare 85 microlitri di EDC in una provetta. Chiuderla con il tappo e posizionarla nel sito tre.

Utilizzare lo stesso volume di NHS nella posizione quattro. Si noti che il file cinque deve essere chiuso e vuoto affinché lo strumento possa mescolare ED, C e NHS in questo file. Ricordare inoltre di riempire il file di lavaggio nella posizione H2O con acqua deionizzata fresca.

Quando il rack è riempito secondo lo schema visualizzato sullo schermo, fare clic su "carica campioni" e inserire il rack nello strumento. Una volta caricato il rack, fare clic su "avanti". Prima dell'avvio della corsa, viene mostrata una checklist.

Assicurarsi che tutti i punti elenco siano soddisfatti quando lo sono. L'esecuzione viene avviata premendo il pulsante di avvio. L'esecuzione viene avviata durante la procedura di immobilizzazione.

I dati vengono raccolti in tempo reale. Innanzitutto, vengono iniettati i reagenti di accoppiamento. Successivamente, l'acido p-aminofenilpropionico (pape) viene accoppiato alla superficie del chip e la procedura termina con la disattivazione degli esteri attivi residui.

Al termine della corsa, una finestra di dialogo riassume il risultato dell'esecuzione. In questa finestra viene visualizzato il livello di immobilizzazione. L'intera procedura di accoppiamento dovrebbe portare all'immobilizzazione di circa 3000 RU di papaína.

Dopo aver immobilizzato la papaina sul chip del sensore, iniziare l'analisi CFCA diluendo i campioni del mutante della cistatina B a una concentrazione totale di circa 10 nanomolari in almeno 300 microlitri. Registrare il fattore di diluizione poiché verrà utilizzato successivamente nell'allestimento del saggio. Iniziare aprendo la finestra di dialogo guidata come descritto nella sezione precedente nella sezione concentrazione della cartella del saggio.

Scegliere "senza calibrazione", quindi selezionare "nuovo". La prima schermata della procedura guidata mostra la sequenza di iniezione. Le impostazioni possono rimanere invariate poiché in questo caso si utilizza un chip sensore CM5 e un approccio di saggio a immobilizzazione diretta.

Fare clic su "Avanti" nella schermata successiva. Lasciare selezionate le caselle di controllo "prime prima dell'esecuzione" e "esegui cicli iniziali". Inoltre, mantenere invariato il numero predefinito di cicli iniziali, pari a tre.

Immettere il tampone heaps nel campo del nome della soluzione. Quindi fare clic su avanti. Nella schermata successiva, inserire il nome della soluzione di rigenerazione, ovvero idrossido di sodio 20 millimolare.

Lasciare invariati gli altri parametri. Fare clic su avanti per visualizzare la tabella dei campioni. Configurare i campioni in base alla tabella dei campioni.

Ogni riga nella tabella dei campioni produce due cicli. Uno con una portata di 10 microlitri al minuto e uno con 100 microlitri al minuto. Iniziare la corsa con un bianco.

Quindi inserire il nome, il fattore di diluizione, il coefficiente di diffusione a 20 gradi Celsius e il peso molecolare. Per ogni mutante, il coefficiente di diffusione può essere calcolato utilizzando lo strumento web disponibile sul sito del prodotto. Un collegamento a questo strumento è fornito nel navigatore della guida del software.

Dato che si raccomanda di eseguire ogni campione in duplicato, copiare l'intera tabella dalla riga vuota fino all'ultimo campione e incollarla nella parte inferiore della tabella. Fare clic su "avanti" per procedere. Nella schermata successiva viene visualizzato il supporto per i campioni.

Posizionare i campioni e i reagenti nel rack secondo la disposizione indicata dal software. Caricare il rack nello strumento premendo il pulsante per il caricamento dei campioni. Quindi fare clic su avanti.

Dopo aver caricato i campioni, viene visualizzata una schermata di promemoria con un elenco di controllo. Assicurarsi di verificare ogni voce, quindi premere avvio. I dati vengono raccolti in tempo reale durante l'esecuzione.

Al termine dell'esecuzione, chiudere la finestra che mostra i dati raccolti. Osservare che un nuovo elemento risultato è apparso nella finestra principale. Per calcolare le concentrazioni a partire dai dati, selezionare il nuovo elemento risultato e fare clic sul pulsante.

Valutare tramite core X 100. Avviare il software di valutazione che mostra tutti i dati raccolti dalla barra degli strumenti; selezionare l'analisi della concentrazione, quindi scegliere calibrazione libera dal menu. Nella prima finestra, scegliere i dati da includere nell'analisi.

Scorri l'elenco e passa attraverso l'elenco delle visualizzazioni per vedere i dati di tutti i campioni. Se desideri escludere alcuni dati, rimuovi il segno di spunta dall'elenco. Fai clic su avanti per avviare il calcolo.

Il modello di interazione CFCA viene automaticamente adattato ai dati sperimentali; al termine dell'adattamento, i risultati vengono riportati per ogni campione nella finestra dei risultati. Esaminare gli adattamenti per ciascun campione selezionando la riga corrispondente nella tabella. La colonna denominata concentrazione misurata mostra la concentrazione nel campione che è stato analizzato.

La concentrazione nel campione originale viene calcolata utilizzando il fattore di diluizione inserito in precedenza e mostrato nella colonna della concentrazione calcolata; al termine, fare clic su fine per salvare il risultato. Ora che conosciamo le concentrazioni delle proteine ottenute dall'analisi CFCA, disponiamo di una solida base per le successive misurazioni cinetiche. L'analisi cinetica ci aiuterà ora a comprendere l'importanza dei residui amminoacidici chiave per il meccanismo di legame.

Iniziamo con la configurazione dell'analisi cinetica. L'analisi cinetica inizia inserendo un nuovo chip sensore CM5 nello strumento dalla schermata iniziale. Scegliere di creare un flusso di lavoro per l'affinità cinetica.

Nell'angolo in alto a sinistra appare una finestra di dialogo in cui vengono inserite le informazioni relative al ligando. Inserire il nome papaina nel campo del nome del ligando e scegliere un'altra proteina dall'elenco dei tipi di specie. Quindi selezionare l'opzione di immobilizzare il ligando in modo covalente utilizzando il chip sensore CM5 tra i due approcci alternativi di fissaggio del ligando proposti; a questo punto il flusso di lavoro raccomandato per il saggio viene visualizzato sul lato destro della finestra.

Inizia con un passaggio di immobilizzazione seguito da un passaggio di saggio. Premere continua per procedere. Salvare il flusso di lavoro del saggio come richiesto inserendo un nome e premendo salva.

Il software ora delinea il flusso di lavoro del saggio con pulsanti associati a ogni passaggio. Il primo passaggio nella preparazione della superficie del sensore è trovare un pH di mobilizzazione. Poiché questo pH è noto, premere "inserisci valore noto" nella finestra di dialogo che appare.

Inserire il nome del tampone "acetato" e pH 4,5 quindi scegliere "salva". Il flusso del saggio viene ora aggiornato con un segno di spunta verde per indicare che questo passaggio è stato completato. A questo punto è necessario immobilizzare: premere il pulsante di esecuzione nel passaggio di immobilizzazione.

Questo apre lo stesso procedimento guidato utilizzato per il propano e l'immobilizzazione nell'analisi CFCA; l'immobilizzazione della papaina per l'analisi cinetica viene configurata nello stesso modo, con l'unica differenza che qui viene iniettata una soluzione più diluita per un tempo inferiore. Questo al fine di immobilizzare una quantità minore di papaina, evitando situazioni in cui le velocità di legame delle cistatine o dei loro mutanti siano limitate dalla diffusione, consentendo così di misurare i dati cinetici in modo isolato. Poiché il nome del ligando e il pH di immobilizzazione sono stati inseriti nei passaggi precedenti del flusso di lavoro del saggio, entrambi sono già preimpostati in questa fase.

L'unico aggiornamento richiesto è di 50 secondi per il tempo di contatto. L'immobilizzazione procede quindi come mostrato in precedenza. Il legame previsto dopo il livello di immobilizzazione è di 50 R ru.

Una spunta verde accanto al pulsante di esecuzione indica che l'immobilizzazione è completa. Successivamente, inserire la soluzione di rigenerazione nel flusso di lavoro nel passaggio. Trovare le condizioni di rigenerazione cliccando su inserisci valori noti nella finestra di dialogo che appare.

Inserire la soluzione di rigenerazione e il tempo di contatto. Quindi fare clic su salva. Ora che il ligando è immobilizzato e le condizioni di rigenerazione sono state inserite, è tutto pronto per generare i dati cinetici nella finestra Affinity dell'analisi cinetica: premere il pulsante di esecuzione per il primo passaggio della cinetica.

L'assistente di affinità delinea la sequenza di iniezione di ogni ciclo per la cinetica a ciclo singolo, utilizzata in questo caso; non è necessario modificare nulla. Fare clic su avanti per procedere. Nel passaggio successivo, mantenere le impostazioni predefinite che indicano la preparazione del sistema prima dell'esecuzione.

Scegliere di eseguire un singolo ciclo di avvio per equilibrare la superficie del chip. Successivamente, definire i parametri di iniezione per il campione. Poiché la soluzione di rigenerazione è stata specificata in precedenza e l'impostazione è predefinita, non è necessario modificare alcun parametro nella schermata.

Fare clic su avanti. Infine, specificare i campioni. Inserire due righe per ciascuna variante mutante, una vuota e l'altra con il campione.

Un ciclo vuoto è indicato impostando il parametro della concentrazione più alta a zero. Due varianti della cistatina B possono essere analizzate in ogni esecuzione. Per ogni mutante, inserire il peso molecolare, la concentrazione più alta e il fattore di diluizione, quindi premere avanti.

Nella schermata seguente, viene indicata la posizione dei campioni sulla rack. Preparare una serie di diluizioni dei campioni proteici e posizionare le provette con tappo sulla rack come indicato a schermo. Una provetta contenente tampone viene posta nella posizione 13 e una provetta con soluzione rigenerante nella posizione 14. Assicurarsi di riempire la posizione dell'acqua con acqua fresca.

Posizionare il rack nella macchina e caricare i campioni premendo il pulsante "carica campioni" e fare clic su "avanti". Come in precedenza, eseguire un controllo finale prima di procedere con l'esecuzione dell'esperimento premendo "inizia"; i dati dell'interazione appariranno in tempo reale. Al termine della corsa, procedere immediatamente con l'esecuzione delle rimanenti varianti della cistatina B secondo quanto appena dimostrato.

Se le rimanenti varianti della cistatina B vengono eseguite in successione, omettere il passaggio di inizializzazione e il ciclo di avvio deselezionando le caselle corrispondenti nel passaggio. Al termine di ogni esecuzione, i dati possono essere accessibili tramite il collegamento. Tutti i risultati nel flusso di lavoro del saggio.

Viene visualizzata una finestra di dialogo con tutti i risultati generati all'interno di questo flusso di lavoro. Per calcolare le costanti cinetiche, selezionare il risultato da valutare e premere valuta: un software di valutazione Core X 100 viene avviato nuovamente mostrando tutti i dati complessivi. Selezionare cinetica affinità dal menu della barra degli strumenti.

Nella prima schermata, viene selezionato il mutante cisteina tre a siriano per la valutazione. I dati provenienti da questo mutante vengono visualizzati insieme alla corsa vuota effettuata per questo mutante; procedere facendo clic su Avanti. La schermata successiva mostra i dati con la corsa vuota sottratta dalla corsa con il campione.

Scegliere di valutare la cinetica facendo clic sul pulsante cinetica. A questo punto, scegliere di adattare i dati a un modello di interazione uno a uno. Cliccando sul pulsante adatta, l'adattamento viene visualizzato sullo schermo mentre viene calcolato.

Una volta pronto, i controlli di qualità vengono applicati automaticamente e evidenziati nella parte inferiore. Esaminare gli elementi del controllo di qualità, quindi osservare i dati del grammo sensore per assicurarsi che i grammi sensore mostrino una curvatura sufficiente. Inoltre, controllare il grafico dei residui che mostra le differenze tra i dati raccolti e il modello interpolato.

Prestare attenzione a deviazioni sistematiche e non casuali. Questo adattamento è accettabile. Ora esaminare i dati cinetici nella scheda del rapporto.

Costante di velocità di associazione, costante di velocità di dissociazione e costante di dissociazione all'equilibrio. Al termine, premere fine e ripetere la stessa procedura per tutti gli altri mutanti. Di seguito sono riportati risultati rappresentativi dell'analisi CFCA per le diverse varianti della cistatina B esaminate.

I dati della concentrazione di legame specifico vengono estratti dai sensogrammi ottenuti a flussi di 10 e 100 microlitri al minuto. Confrontando la concentrazione determinata mediante una misurazione a due cicli con quella determinata mediante CFCA, è chiaro che, sebbene nella maggior parte dei casi la proteina sia completamente attiva per la variante leucina 73 glicina, la frazione di proteina attiva è molto bassa. La cinetica del legame delle varianti della cistatina B al pepin viene determinata utilizzando la cinetica a ciclo singolo.

I grafici del sensore mostrano dati sottratti del bianco e del riferimento con la cinetica per un modello di interazione uno-a-uno sovrapposto in nero. La concentrazione di legame specifico misurata mediante CFCA per la variante leucina 73 è solo circa il 10% della concentrazione totale di proteina determinata mediante una misurazione a due 80. Quando si utilizza la concentrazione corretta nel calcolo dei parametri cinetici, risulta chiaro che la velocità di associazione per Lucien 73 è simile a quella delle altre varianti.

Sebbene le velocità di associazione dei mutanti siano paragonabili a quelle della proteina di tipo selvaggio, la costante di velocità di dissociazione dei mutanti può essere superiore di quasi due ordini di grandezza, con un corrispondente aumento della costante di dissociazione all'equilibrio. L'affinità ridotta dipende principalmente da velocità di dissociazione aumentate, indicando che sia il secondo loop di legame sia l'estremità C-terminale della cistatina B contribuiscono all'affinità di legame mantenendo l'inibitore legato all'enzima una volta formato il complesso. L'uso dell'analisi di concentrazione senza calibrazione è stato essenziale per questa conclusione, poiché uno dei mutanti si è rivelato avere un'attività di legame molto bassa. Il mio collega Pol vi ha ora mostrato come utilizzare il bi core X 100 in uno studio funzionale strutturato. Quando si eseguono questi esperimenti, è importante ricordare che, sebbene sia l'analisi di concentrazione sia quella cinetica si basino sulla stessa procedura di legame, le condizioni sperimentali sono piuttosto diverse.