Determinazione della reattività e Titolo di siero usando un test dell'emoagglutinazione

Determinazione della reattività e del titolo del siero mediante un saggio di emagglutinina. Una reazione di agglutinazione è un processo che avviene tra anticorpi solubili e antigeni particellati. Questi possono includere cellule o molecole portanti.

Gli epitopi presenti sulla superficie del vettore permettono a un anticorpo di legarsi e di cross-linkare il vettore, portando alla formazione di un reticolo complesso chiamato complesso antigene-anticorpo. L'emagglutinazione è una forma specifica di agglutinazione in cui gli anticorpi si legano ai globuli rossi, che fungono da antigene particellato. I globuli rossi sono bersagli utili poiché sono facilmente disponibili e i risultati possono essere osservati facilmente ad occhio nudo.

I campioni di siero vengono diluiti in modo seriale e quindi aggiunti in una piastra 96 pozzetti di tipo ubo. Viene quindi aggiunta una sospensione di globuli rossi, cellule Riva. Quando sono presenti anticorpi ad alta concentrazione, questi si legano ai globuli rossi formando un reticolo di grandi dimensioni.

Mentre questo reticolo si deposita per gravità, assume la forma della piastra ubo. Osservando dall'alto, si nota un ampio strato di globuli rossi. Questa è una reazione positiva di emagglutinazione.

Quando i livelli di anticorpi sono bassi, non può formarsi un reticolo e i globuli rossi assumono la forma della piastra UBO concentrandosi alla base, formando un piccolo pellet. Questa è una reazione negativa di emagglutinazione. Questo diagramma mostra una reazione positiva.

Le cellule formano un reticolo mentre si depositano, adattandosi alla forma della piastra con fondo a U. A sinistra e a destra, vediamo la vista dall'alto in cui appare un ampio strato di globuli rossi. Se è presente una quantità intermedia di anticorpi, si osserverà la formazione di alcune lettere.

L'agglutinazione ematica consente inoltre di verificare la reattività di diversi campioni sierici contro l'antigene noto. È anche possibile determinare il titolo del campione sierico. Per titolo si intende l'ultima diluizione in cui è stata osservata una reazione positiva.

Normalmente, maggiore è la concentrazione di anticorpi nel campione di siero, maggiore è il titolo. Questo diagramma mostra una reazione negativa di emagglutinazione. Anticorpi insufficienti presenti per formare legami incrociati tra i globuli rossi.

Mentre le cellule si depositano per gravità, scivolano lungo il lato del pozzetto formando un pellet compatto sul fondo. Il diagramma a destra mostra i globuli rossi visti dall'alto. Per questo esperimento, sarà necessaria 1 piastra a 96 pozzetti con fondo a U.

È fondamentale utilizzare una piastra con fondo a U, poiché le piastre con fondo piatto non permettono alle cellule di sedimentare formando un pellet, rendendo così impossibile l'interpretazione. Utilizzare una pipetta in grado di aggiungere 50 microlitri di siero, una sospensione al 1% di cellule Riva e una soluzione tampone salina verone in ciascun pozzetto della riga. Da A1 a A12, aggiungere 50 microlitri di tampone salino roal.

Questo viene utilizzato come diluente. Ora aggiungere 50 microlitri di siero nel pozzetto A1. Questa è la prima diluizione uno a due.

Utilizzando il perpet, assicurarsi che il campione di siero sia mescolato accuratamente. Una volta mescolato, prelevare 50 microlitri dal pozzetto A1 e trasferirli nel pozzetto A2. Questa è la seconda diluizione uno a due, ottenendo così una diluizione quattro volte maggiore.

Proseguire questa serie di diluizioni utilizzando le pozzette dalla tre all'undici. Non aggiungere alcun siero nella pozzetta 12, poiché questa rappresenta il controllo negativo con soluzione salina tampone. Prelevare ora la sospensione al 1% di cellule Riva, che è stata accuratamente mescolata, e trasferire 50 microlitri dalla pozzetta A1 fino alla pozzetta A12.

Dopo aver aggiunto le cellule, coprire la piastra e battere delicatamente per assicurare un'adeguata miscelazione dei campioni e delle cellule. Incubare ora a 37 gradi per 60 minuti. È adatto un incubatore umidificato.

Durante il periodo di incubazione di 60 minuti, avranno luogo le interazioni tra antigene e anticorpo e le cellule inizieranno a sedimentare. Le immagini video che state osservando costituiscono una fotografia in time-lapse dell'intero periodo di 60 minuti. Si tratta di un ingrandimento dei pozzetti da cinque a dieci.

Abbiamo già esaminato, bene, il pozzetto 12, che era il vostro controllo VBS in questo caso. Le cellule avevano formato un pellet compatto, indicando che il saggio aveva funzionato correttamente. I pozzetti cinque e sei sono esempi di emagglutinazione positiva.

Bene, il pozzetto sette è un esempio di risultato di agglutinazione intermedio, mentre i pozzetti otto, nove e dieci sono negativi per l'emagglutinazione. Sulla base di questo risultato, il titolo verrebbe determinato in base al diluizione del pozzetto sette, poiché è stato l'ultimo pozzetto in cui è stata osservata una reazione positiva.