Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

E Coli RP 4 37 vengono introdotti in un dispositivo di chemotassi in cui sono esposti a una concentrazione spaziale definita. I gradienti a cui le cellule sono esposte entrando nella camera incontrano il punto medio del gradiente di concentrazione. A seconda che il segnale venga percepito come un attrattante o un repellente, i batteri si muovono rapidamente verso l'alto o verso il basso lungo il gradiente di concentrazione.

Ciao, sono Derek Engler del Laboratorio di Biotecnologia Molecolare dei Sistemi e del Dipartimento di Ingegneria Chimica della Texas A&M University. Oggi vi mostreremo un procedimento per lo studio della chemotassi batterica in un dispositivo microfluidico. Utilizziamo questo procedimento nei nostri laboratori per studiare come l'e coli RP 4 37 migra in un gradiente di concentrazione di solfato di nichel.

Iniziamo. Lo strato fluidico e lo strato di controllo sono realizzati mediante stampaggio per replica di Polymethyl SUBOXANE o PDMS a partire dal master SU eight. Per iniziare questa procedura, mescolare il prepolimero di PDMS e l'agente di reticolazione in un rapporto ponderale di 10 a 1.

Depurare la miscela in un essiccatore per un'ora, fino a quando non vengono rimossi i bollicine d'aria. Quando la miscela di PDMS è pronta, posizionare il master SU eight in una piastra di Petri e versare con attenzione la miscela sopra il master SU eight fino allo spessore desiderato. Riscaldare la piastra di Petri contenente la miscela di PDMS e il master stampo SU eight a 80 gradi Celsius per due ore per indurire il PDMS.

Dopo due ore, rimuovere dalla piastra riscaldata il PDMS polimerizzato contenente la replica negativa dell'SSU eight master e staccare con cura il mold in PDMS dall'SU eight master. Per realizzare la struttura desiderata nel mold in PDMS, utilizzare un ago senza punta calibro 20 per praticare quattro fori nel mold in PDMS, destinati al collegamento dei tubicini al generatore di gradiente, all'ingresso delle cellule e all'uscita delle cellule. A questo punto siamo pronti per assemblare il dispositivo in PDMS e procedere alla sua saldatura.

Per prima cosa, pulire un vetrino in vetro con isopropanolo e asciugarlo con un flusso d'aria. Successivamente, esporre il calco in PDMS e il vetrino in vetro a un plasma di ossigeno in un etcher al plasma per circa 30 secondi. Mettere a contatto il calco in PDMS con il vetrino in vetro. Riscaldare il vetrino e il calco in PDMS a contatto a 65 gradi Celsius su una piastra riscaldante per 15 minuti.

Per assemblare il dispositivo in PDMS, utilizzare un rasoio per tagliare il tubo con un angolo di 45 gradi alla lunghezza corretta necessaria in base al setup del microscopio. Quindi, utilizzando pinze, inserire un'estremità del tubo in uno dei quattro fori praticati nel dispositivo.

Inserire un ago ottuso da 30 gauge nell'altra estremità del tubo. Ripetere l'inserimento del tubo e del connettore dell'ago in tutti i fori rimanenti. Caricare un millilitro di chemiotassanti, tampone o CB in una siringa da tre millilitri.

Avendo cura di rimuovere l'aria dalla siringa. Aggiungere CB all'attacco del connettore dell'ago utilizzando una pipetta e battere leggermente sull'attacco per eliminare eventuali bolle d'aria. Espellere una piccola quantità di CB dalla punta della siringa da tre millilitri e collegare la siringa al connettore dell'ago senza intrappolare aria.

Spingere il CB attraverso il dispositivo fino a quando tutti i connettori rimanenti dell'ago sono riempiti di cb. Questo dovrebbe rimuovere la maggior parte delle bolle d'aria. Successivamente, riempire due siringhe da 500 microlitri con CB contenente le concentrazioni appropriate dell'effettore chimico in fase di test.

Eliminare la formazione di bolle d'aria espellendo una piccola goccia del contenuto della siringa e toccando le gocce di liquido nell'attacco dell'ago, quindi attaccare la siringa per preparare batteri altamente mobili. Per l'esperimento di chemotassi, coltivare una coltura notturna di E. coli RP437 con espressione di GFP, in brodo tripton o TB a 32 gradi Celsius con agitazione; il giorno successivo, utilizzare la coltura notturna per inoculare una coltura di 20 millilitri di TB in un matraccio Erlenmeyer da 250 millilitri fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri di circa 0,05.

Coltivare la coltura a 32 gradi Celsius con agitazione quando le cellule presentano un OD 600 di circa 0,35-0,45. Raccoglierle mediante centrifugazione a bassa velocità e risospendere le cellule a un OD 600 di circa 0,35 in CB contenente l'effettore chimico alla concentrazione prevista nella parte centrale del canale. Infine, aggiungere cellule morte marcate con RFP a un OD 600 di circa 0,35 alle cellule vive che esprimono GFP.

Queste cellule morte fungeranno da controllo interno per assicurare che qualsiasi migrazione non sia dovuta a effetti di flusso. La sospensione cellulare è ora pronta per essere caricata nel dispositivo microfluidico per l'esperimento di chemotassi. Per iniziare l'esperimento di chemotassi, rimuovere parte del CB dall'ago di caricamento delle cellule e ricaricare con la sospensione cellulare.

Riempire delicatamente una siringa da 50 microlitri con le cellule risospese. Eseguire questa operazione lentamente, poiché le flagelle possono rompersi, riducendo così la motilità. Collegare la siringa da 50 microlitri al connettore dell'ago di ingresso come mostrato in precedenza, espellendo una piccola goccia del contenuto della siringa e toccando con essa il liquido presente nel connettore dell'ago; quindi fissare la siringa e posizionare il dispositivo sul palchetto di un microscopio a fluorescenza dotato di una telecamera ad alta velocità per l'acquisizione delle immagini.

Posizionare entrambe le siringhe di ingresso nella pompa per siringhe e avviare il flusso in modo da formare il gradiente e far passare le cellule attraverso il tubo. Una volta che le cellule entrano nella camera di chemotassi, attendere circa 20 minuti affinché il sistema si stabilizzi. Prima dell'acquisizione, raccogliere immagini in fluorescenza verdi (vitali) e rosse (morte) in diverse posizioni lungo la lunghezza della camera.

Normalmente acquisiamo 100 immagini in ogni posizione a intervalli di tre secondi. Le immagini di fluorescenza acquisite possono essere analizzate utilizzando qualsiasi programma di analisi delle immagini disponibile in commercio, come ImageJ o Metamorph, oppure mediante semplici codici scritti in MATLAB. In questo esempio, utilizzeremo codici MATLAB.

Iniziare rimuovendo i pixel di sfondo dall'immagine mediante questa soglia di intensità dei pixel e eliminare tutti i pixel con intensità inferiore alla soglia. Ciò riduce al minimo il rumore. Nell'analisi, utilizzare la posizione delle cellule morte per determinare il centro dell'immagine.

Questa è la posizione in cui le cellule sono entrate nella camera di chemotassi e in cui verrebbero rilevate in assenza di qualsiasi migrazione. Successivamente, individuare le cellule vive nell'immagine, suddividere l'immagine in canali e determinare il numero di cellule vive in ciascun canale. Nel nostro lavoro precedente, la camera di chemotassi larga da 10 a 50 micrometri è stata suddivisa in 64 canali, ciascuno largo circa 16 micrometri.

Dopo aver ripetuto questi passaggi per tutte le immagini, alcuni dei conteggi totali di cellule per ogni canale su tutte le immagini. Ciò fornisce il numero totale di cellule rilevate in ogni canale durante l'intera durata dell'esperimento. Calcolare il chemotassi, coefficiente di partizione o CPC, che rappresenta la direzione della migrazione.

Eseguendo i seguenti passaggi, assegnare un moltiplicatore di più uno e meno uno a ciascuna cellula situata rispettivamente nei lati ad alta concentrazione o destro e a bassa concentrazione o sinistro rispetto alle cellule morte. Sommare tutti i valori moltiplicati e normalizzare rispetto al numero totale di cellule rilevate. Calcolare il coefficiente di chemotassi, coefficiente di migrazione o CMC, che pesa la migrazione delle cellule in base alla distanza percorsa.

A una cellula che si sposta nel canale della posizione con la concentrazione più alta, ovvero il canale 64, viene assegnato un fattore di ponderazione pari a più uno, mentre a una cellula che si sposta a metà strada verso il lato ad alta concentrazione viene assegnato un fattore di ponderazione pari a più 0,5. Una cellula che si sposta nella posizione con la concentrazione più bassa viene ponderata con meno uno. La somma di tutti i conteggi di cellule ponderati viene normalizzata rispetto al numero totale di cellule per generare il CMC.

Questo grafico mostra un gradiente di concentrazione lineare o profilo formato nel dispositivo microfluidico utilizzando isotiocianato di fluoresceina. La formazione di un gradiente di concentrazione è dimostrata in questa figura mediante coloranti blu e gialli. L'ingresso per le cellule era CA in modo che non ci fosse flusso attraverso di esso, e si può osservare che si forma una gamma di colori compresi tra il blu e il giallo.

Di seguito sono mostrate immagini in pseudocolore di un esperimento rappresentativo di chemiotassi in cui E. coli RP437 è stato esposto a un gradiente compreso tra zero e 100 micromolar di L-aspartato o tra zero e 225 micromolar di solfato di nichel nel dispositivo. La migrazione dei batteri verdi vivi verso l’aspartato o lontano dal nichel è stata ripresa ogni 2,5 secondi per 30 minuti. I batteri morti, mostrati in rosso, sono serviti come controllo per gli effetti del flusso nel dispositivo.

La distribuzione spaziale di RP 4 37 nel dispositivo microfluidico in assenza di un gradiente è mostrata in questo grafico, in confronto alla sua risposta a un gradiente di aspartato e a un gradiente di solfato di nichel. Abbiamo appena illustrato come monitorare le chemiotassi di e coli RP 4 37 in un gradiente di solfato di nichel. Durante questa procedura, è importante ricordare di minimizzare il vorticoso mescolamento delle cellule, in modo da poter utilizzare una sottopopolazione ad alta motilità.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.