Un semplice composito Sistema di punteggio per la valutazione Fenotipo modelli murini di atassia cerebellare

Abbiamo sviluppato un sistema composito di valutazione fenotipica per la valutazione della gravità e del decorso della malattia. Nei modelli murini di atassia cerebellare, eseguiamo quattro test diversi: il test del bordo, il test degli arti posteriori, il test di accavallamento degli arti, l’andatura e la cifosi, utilizzando una scala da zero a tre per ciascun test, per un punteggio complessivo da zero a 12. Tra tutte e quattro le misurazioni, il test del bordo si è dimostrato utile per misurare direttamente la coordinazione.

Il raggruppamento degli arti posteriori è un indicatore di progressione della malattia in diversi modelli murini di neurodegenerazione. L'andatura rappresenta una misura della coordinazione e della funzione muscolare. La cifosi è una curvatura della colonna vertebrale a livello cervico-toracico, comune nei modelli murini di neurodegenerazione del sistema motorio e del cervelletto spinale; ogni test viene eseguito e il punteggio registrato.

Viene calcolata e riportata la somma media dei quattro punteggi o il punteggio medio del fenotipo composito per ciascun gruppo di topi. Quando si applica questo protocollo a diversi modelli murini, è importante analizzare prima i punteggi dei singoli test per determinare la combinazione ideale delle quattro misure descritte. Questo protocollo specifico è stato progettato per discriminare tra individui affetti e non affetti, quantificando al contempo la progressione del fenotipo della malattia nei modelli murini di atassia spinocerebellare.

Tipo sette. Ciao, sono Stephanie Fur del laboratorio del Dottor Gwen Garden del Dipartimento di Neurologia dell'Università di Washington. Oggi vi mostreremo un metodo semplice e sensibile per valutare la gravità della malattia in modelli murini di atassia cerebellare.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per quantificare le differenze fenotipiche nei modelli murini di atassia spinocerebellare di tipo sette o SCA sette, e per seguire l'evoluzione del fenotipo SCA sette nel tempo. Cominciamo dunque. Il test del bordo è una misura diretta della coordinazione, che risulta compromessa nelle atassie cerebellari e in molte altre malattie neurodegenerative.

Questo misura i segni più direttamente confrontabili con quelli umani dell'atassia cerebellare, al fine di evitare bias. L'esperimentatore che effettua le valutazioni non deve conoscere il genotipo dell'animale. Durante le valutazioni, ciascuna misura viene assegnata su una scala da zero a tre, dove zero indica l'assenza del fenotipo e tre indica la sua manifestazione più grave.

Iniziare sollevando il topo dalla gabbia e posizionandolo sul bordo della gabbia. Osservare il topo mentre cammina lungo il bordo della gabbia e si abbassa all'interno della gabbia. Un topo di tipo selvatico camminerà lungo il bordo senza perdere l'equilibrio e si abbasserà con grazia all'interno della gabbia utilizzando le zampe.

A questo comportamento viene assegnato un punteggio pari a zero. Se il topo perde l'appoggio mentre cammina lungo il bordo, ma in generale appare coordinato, riceve un punteggio di uno. Se non utilizza efficacemente le zampe posteriori o non riesce a scendere con grazia nella gabbia.

Riceve un punteggio di due se cade dal bordo o quasi mentre cammina o tenta di abbassarsi, oppure se trema e rifiuta di muoversi del tutto. Nonostante gli incoraggiamenti, riceve un punteggio di tre. Eseguire il test del bordo tre volte per garantire una misurazione accurata e registrare il punteggio del test del bordo.

Ora vediamo come valutare il raggruppamento degli arti posteriori. Il raggruppamento degli arti posteriori è un indicatore della progressione della malattia in diversi modelli murini di neurodegenerazione, inclusi alcuni tipi di atassia cerebellare. Per iniziare la valutazione, afferrare la coda vicino alla base e sollevare l'animale, eliminando ogni altro oggetto circostante.

Osservare la posizione degli arti posteriori per circa 10 secondi. Se gli arti posteriori sono costantemente divaricati verso l'esterno rispetto all'addome, viene assegnato un punteggio di zero. Se un arto posteriore è retratto verso l'addome per più del 50% del tempo di sospensione, riceve un punteggio di uno.

Se entrambi gli arti posteriori sono parzialmente ritratti verso l'addome per più del 50% del tempo in sospensione, si assegna un punteggio di due. Se gli arti posteriori sono completamente ritratti e toccano l'addome per più del 50% del tempo in sospensione, si assegna un punteggio di tre. Eseguire il test tre volte e registrare il punteggio di accavallamento degli arti posteriori.

Ora vediamo come valutare l'andatura. Il test dell'andatura è una misura della coordinazione e della funzione muscolare. Per iniziare il test, rimuovere il topo dalla sua gabbia e posizionarlo su una superficie piana con la testa rivolta lontano dall'osservatore.

Osservare il topo da dietro mentre cammina. Se il topo si muove normalmente con il peso del corpo sostenuto da tutti gli arti, con l'addome che non tocca il suolo e con entrambi gli arti posteriori che partecipano in modo uniforme, riceve un punteggio pari a zero. Se presenta un tremore o sembra zoppicare durante la deambulazione, oppure se i piedi sono leggermente ruotati verso l'esterno rispetto al corpo, riceve un punteggio pari a uno.

Se presenta un tremore grave, una zoppia grave, un bacino abbassato o i piedi deviano in modo più marcato rispetto al corpo durante la deambulazione, viene assegnato un valore pari a due. Se il topo ha difficoltà a muoversi in avanti e trascina l'addome lungo il suolo, riceve un valore pari a tre. Osservare tre volte la GA del topo e registrare il punteggio ottenuto.

Ora vediamo. Il test della cifosi valuta la cifosi, una curvatura dorsale caratteristica della colonna vertebrale, che rappresenta una manifestazione comune di malattie neurodegenerative che coinvolgono i sistemi motori, inclusa l'atassia spinocerebellare nei modelli murini.

È causata dalla perdita del tono muscolare nei muscoli spinali secondaria alla neurodegenerazione. Per iniziare, rimuovere il topo dalla sua gabbia e posizionarlo su una superficie piana. Osservarlo mentre cammina.

Se il topo è in grado di raddrizzare facilmente la spina dorsale durante la deambulazione e non presenta cifosi persistente, riceve un punteggio pari a zero. Se il topo mostra una cifosi lieve ma è comunque in grado di raddrizzare la spina dorsale, riceve un punteggio pari a uno. Se non è in grado di raddrizzare completamente la spina dorsale e mantiene una cifosi persistente, sebbene lieve, riceve un punteggio pari a due.

Se il topo mantiene una cifosi pronunciata mentre cammina o quando è seduto, gli viene assegnato un punteggio di tre. Osservare il punteggio della cifosi del topo per tre volte. Rimettere il topo nella sua gabbia e registrare il suo punteggio di cifosi.

Di seguito è riportato un grafico rappresentativo della valutazione del fenotipo composito in un modello transgenico murino di atassia spinocerebellare di tipo sette noto come SCA7 92Q raggruppato. I punteggi delle quattro misurazioni sono stati sommati per ogni topo e il punteggio composito medio è stato calcolato per entrambi i genotipi a ogni età. In questo caso, i topi SCA7 92Q raggruppati mostrano un fenotipo progressivo di SCA7 significativamente diverso rispetto ai soggetti littermate non transgenici. In modo importante, l'aumento del punteggio fenotipico nel tempo è coerente con la natura progressiva della malattia umana.

Abbiamo appena mostrato come utilizzare un sistema di punteggio fenotipico composito per valutare la gravità e la progressione della malattia in modelli murini di atassia cerebellare. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che l'obesità rappresenta un fattore confondente in tutti e quattro i test descritti. I risultati dei singoli test possono essere analizzati separatamente per determinare innanzitutto la loro combinazione ideale all'interno di un sistema di punteggio fenotipico composito, il più appropriato per il vostro modello murino.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.