Primario cellule epiteliali bronchiali umane Grown da espianti

In questo articolo descriviamo un protocollo per la crescita e l'espansione di cellule epiteliali bronchiali umane ottenute da segmenti bronchiali umani appena isolati. Questo protocollo comprende cinque sezioni: codifica e graffiatura, piastre di coltura da cento millimetri, riparazione del tessuto bronchiale, trapianti di tessuto bronchiale espiantato e passaggio di cellule epiteliali bronchiali umane ciliate in crescita, cellule epiteliali bronchiali umane su transwell. Prima di iniziare, si noti che tutti i passaggi vengono eseguiti all'interno della cappa a sicurezza biologica.

Salvo diversa indicazione, leggere la sezione sui materiali, i reagenti e la preparazione e assicurarsi di aver effettuato i preparativi di base. I seguenti passaggi: codifica, soluzioni di dissociazione, soluzioni di rivestimento e graffiatura, colture con soluzioni stock e terreni di coltura. Le piastre da coltura da cento millimetri devono essere eseguite nel bst.

Mantieni tutto sterile. Posiziona piastre di coltura sterili da cento millimetri e la soluzione di rivestimento. Con la pipetta BST, aggiungi due millilitri di soluzione di rivestimento nella piastra da cento millimetri e agita delicatamente per ricoprire uniformemente la base della piastra.

Assicurarsi che la soluzione di rivestimento copra uniformemente la base della piastra. Aspirare la soluzione rimanente e utilizzarla per rivestire una seconda piastra da cento millimetri. Ripetere per tutte le piastre necessarie.

Il numero di piastre necessarie varia in base al numero di espianti di tessuto. Assicurarsi che la soluzione di rivestimento copra uniformemente la base delle piastre. Come dimostrato.

Coprire le piastre con i relativi coperchi. Lasciare asciugare le piastre nell'incubatrice per uno o due ore ed aspirare la soluzione in eccesso prima dell'uso per l'espianto di tessuto bronchiale. Le piastre per colture rivestite non utilizzate possono essere collocate in un sacchetto sterile e conservate a quattro gradi Celsius per un utilizzo successivo.

Usare forbici piccole e affilate, bisturi e pinzette pulite con etanolo al 70% e portarle nella cappa a flusso laminare. Creare delle incisioni profonde e piccole a forma di X, almeno quattro per piastra, premendo fermamente con il bisturi. Se l'incisione non è abbastanza profonda, i frammenti di tessuto non si depositeranno e galleggeranno fuori dalla siringa. All'esterno della cappa, posizionare il tessuto in una piastra P3. Risciacquare accuratamente il tessuto bronchiale umano isolato in BSS.

Aprire i pezzi bronchiali. Portare il tessuto nel BS e trasferirlo in una piastra sterile per colture cellulari da cento millimetri contenente DMEM Ham F12 più 1% antibiotico-antimicotico. Utilizzare forbici piccole e affilate per tagliare il tessuto in pezzi cubici di due-tre millimetri.

Posizionare un pezzo di tessuto tagliato al centro di ciascuna X con una pinzetta e premere. Lasciare aderire delicatamente i pezzi di tessuto o gli espianti a forma di X alla piastra per alcuni secondi. Quindi aggiungere delicatamente 10 µL di mezzo completo. Se il tessuto galleggia dopo l'aggiunta del mezzo, utilizzare la pinzetta per spingere il tessuto all'interno delle scanalature della X o creare una nuova X. Potrebbe essere necessario realizzare nuove X se le scanalature non sono abbastanza profonde.

Posizionare le piastre nell'incubatrice e cambiare il mezzo ogni tre o quattro giorni; i tessuti sono pronti per il trapianto quando un numero sufficiente di cellule epiteliali si è sviluppato intorno ai tessuti, coprendo aree di uno o due centimetri; ciò richiede circa quattro settimane. Utilizzare piastre rivestite e graffiate da cento millimetri.

Considerato che alcuni espianti di tessuto potrebbero non avere successo, il numero di piastre dipende da quante porzioni di tessuto si stanno trapiantando. Se si utilizzano piastre precedentemente rivestite e conservate a quattro gradi Celsius, portarle a temperatura ambiente prima dell'uso. Con una pinzetta, prelevare con cura il tessuto dalla piastra originale e posizionarlo al centro dell'asse della nuova piastra, premendo delicatamente. I tessuti senza fuoriuscita di crescita devono essere scartati.

Lasciare che il tessuto aderisca alla piastra. Aggiungere il mezzo e incubare per alcuni secondi. Aggiungere quanto descritto in precedenza per l'esperimento X.

Quindi due millilitri di tripsina e soluzione madre di EDTA per ogni piastra da cento millimetri per colture cellulari. Diluire la soluzione madre con sei millilitri di PBS sterile 0,01 molare e due millilitri di soluzione madre in sei millilitri di PBS, per una concentrazione finale di tripsina pari a 250 microgrammi per millilitro e di EDTA pari a cento microgrammi per millilitro. Dopo aver trasferito gli espanti in una nuova piastra, aspirare il mezzo dalle piastre utilizzando anelli di cellule di uno-due centimetri.

Aggiungere otto millilitri di gocce calde diluite ed et un'equivalente di soluzione in ciascuna piastra da cento millimetri. Quindi posizionare in un incubatore a 37 gradi Celsius per tre-quindici minuti. Controllare frequentemente.

Lasciare la tripsina troppo a lungo danneggerà le cellule. Controllare le piastre al microscopio per assicurarsi che la maggior parte delle cellule si sia staccata; le cellule diventeranno rotonde e si distaccheranno come mostrato a otto Mils di calore. Aggiungere il 10% di FBS nel mezzo per piastra per inattivare la soluzione di EDTA.

Unire i volumi di tutte le piastre in un unico tubo o in tubi separati per tessuti diversi. Contare le cellule utilizzando un centrifugo ematocitometro a cento G per cinque minuti. Si formerà un pellet cellulare alla base del tubo; risospendere il pellet cellulare nel mezzo completo alla concentrazione cellulare desiderata.

Posizionare da due a tre milioni di cellule per fiala T75 e aggiungere il mezzo completo secondo necessità. Incubare e sostituire il mezzo. Ogni tre o quattro settimane, le cellule raggiungono la subconfluenza nelle fiale D75.

In circa quattro settimane, le cellule devono essere staccate e ampliate oppure utilizzate in condizioni di subconfluenza per evitare la senescenza. Iniziare preparando le membrane permeabili dei transwell. Utilizzare inserti da 6,5 millimetri adatti per piastre multiple da 24 pozzetti.

Aggiungere mezzo su entrambi i lati della membrana. Sei decimi di millilitro sul fondo e 0,1 millilitri sulla parte superiore. Incubare per un'ora nell'incubatrice per colture cellulari.

Rimuovere con attenzione il mezzo da entrambi i lati della membrana. Iniziare prima dal volume basale, poiché la membrana può essere facilmente danneggiata. Pertanto, pipettare il mezzo lungo il lato dell'inserto per colture, utilizzando il volume raccomandato.

Non farlo comporterà una fuoriuscita di mezzo verso altre pozzette, con conseguente semina indesiderata di cellule. Dopo la pre-incubazione del supporto permeabile, pipettare con attenzione la sospensione cellulare nel lato apicale della membrana per pozzette da 6,5 millimetri, utilizzando 0,1 ml di sospensione cellulare versata nel lato apicale della membrana. Pipettare 0,6 M di mezzo nel lato basale della membrana.

Alimentare le cellule dal lato apicale e basale per 10 giorni. Per stabilire una coltura ben differenziata, sostituire il mezzo due volte alla settimana. Utilizzando il metodo dimostrato, rimuovere il volume basale.

Prima di tutto, sostituire il volume epical, aggiungendo 0,6 mils di mezzo al lato basale della membrana. Questo metodo favorisce l'adesione cellulare alla membrana e impedisce che le cellule siano esposte all'aria per lunghi periodi di tempo. Cambiare rapidamente il mezzo e reinserire nell'incubatrice.

Crea un'interfaccia aria-liquido al giorno 10 rimuovendo il mezzo AAL e sostituendo lo 0,6 ml di mezzo sul lato basale della membrana. Mantieni le cellule all'interfaccia aria-liquido per sei settimane, cambiando il mezzo due volte alla settimana. Le cellule cigliate inizieranno ad apparire quattro settimane dopo la creazione dell'orecchio.

Interfaccia liquida. Le cellule raggiungeranno una differenziazione uniforme in cellule cigliate. Sei settimane dopo la creazione dell'interfaccia liquida dell'orecchio.

Segmenti bronchiali umani con cellule epiteliali sane da espianti e trapianti. Nel nostro studio, colture di successo da espianti del tessuto bronchiale si sono ottenute in otto tessuti su nove. Poiché una delle colture da espianto si è infettata, gli anelli di cellule epiteliali hanno raggiunto un raggio di uno-due centimetri nell'arco di tre-quattro settimane.

Esplantati di successo sono stati coltivati nuovamente fino a sei volte. Tutte le colture di successo mostrano evidenza di migrazione cellulare entro 48 ore dall'inizio dei trapianti, oppure esplantati di X come mostrato nelle cellule B che presentano un aspetto a selciato, caratteristico di queste cellule epiteliali, come illustrato in B. E nelle figure successive, la colorazione immunoistochimica di preparati di citosina di cellule da esplantato e di cellule seminate su coprioggetti ha rivelato che tutte le cellule erano positive per la citocheratina specifica dell'epitelio; cellule bronchiali umane di subcoltura cresciute fino a subconfluenza in fiasche T75 sono mostrate qui. Si noti l'aspetto a selciato.

Le cellule bronchiali umane in subcoltura hanno mostrato una immunomarcatura uniformemente positiva per la cheratina e per E.Can; l'immunomarcatura con anticorpi specifici contro altri tipi cellulari non ha evidenziato alcun segno di contaminazione delle colture da parte di fibroblasti, cellule mesenchimali o cellule endoteliali. Per ulteriori dettagli, si prega di fare riferimento alla figura cinque e alla sua legenda nel testo. Le cellule coltivate su membrane di poliestere permeabili, o su transwell, con o senza interfaccia liquida, si differenziano in epitelio cigliato come qui dimostrato; scartare le cellule e i relativi trapianti se compaiono cellule con una morfologia differente da quella illustrata. In questo protocollo, abbiamo presentato metodi dettagliati per la coltura e l'espansione di cellule epiteliali bronchiali primarie umane.

Sono necessari studi basati su cellule umane per determinare i percorsi importanti dei meccanismi delle malattie polmonari umane e per lo screening tossicologico e farmacologico di nuovi farmaci. Speriamo che i metodi descritti qui possano incoraggiarvi a coltivare cellule epiteliali bronchiali umane da espianti e a utilizzare queste cellule nei vostri sistemi di studio. Grazie e buona fortuna.