Studiare Piscine vescicole sinaptiche con fotoconversione di coloranti Styryl

Questo video illustra la procedura per la fotoconversione del colorante Styro Dye FM 1-43. Per studiare i pool di vescicole sinaptiche in drosophila melanogaster, in primo luogo i larve di drosophila vengono dissecati per esporre i muscoli ventrali che costituiscono la preparazione della giunzione neuromuscolare o NMJ. Le preparazioni vengono incubate in un tampone contenente FM D, mostrato qui in grigio, che marca la membrana cellulare.

Successivamente, vengono stimolati elettricamente o chimicamente per indurre la fusione fisica della vescicola; la membrana viene internalizzata a seguito di ciò. L'esocitosi stimolata verrà colorata con FM D. Il colorante FM extracellulare viene quindi lavato via dalla membrana plasmatica e il tessuto viene fissato sotto un'illuminazione intensa continua. Il colorante viene completamente sbiancato e il colore nero appare a causa della precipitazione del di-ammino-ben.

Questo precipitato può quindi essere visualizzato mediante microscopia elettronica a trasmissione. Ciao, sono Philippe o Paso del laboratorio di Sylvia Olli presso l'Istituto Europeo di Neuroscienze di Gaon, Germania. Oggi vi mostreremo una procedura per la fotoconversione FM della giunzione neuromuscolare inria.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il riciclo delle vescicole sinaptiche. Bene, iniziamo lavorando sotto un microscopio stereoscopico. Iniziate fissando un larva di drosophila con il lato dorsale rivolto verso l'alto in una capsula di Petri rivestita con Sylgard.

Coprirlo con soluzione salina per drosophila utilizzando un ago da siringa e, con le forbici da dissezione, praticare un'incisione longitudinale lungo il lato dorsale. Quindi rimuovere gli organi interni. Successivamente, stirare il preparato e fissarlo nuovamente al piatto di Petri.

Successivamente, diversi muscoli ventrali possono essere utilizzati per proteggere i coloranti FM impiegati in questa procedura dallo sbiancamento. Questa procedura deve essere eseguita in condizioni di luce ridotta. Coprire il preparato di drosophila fissato con soluzione salina per drosophila contenente cloruro di potassio 90 millimolare e FM 1-43 a 10 micromolare per stimolare chimicamente i nervi.

Incubare per un minuto a temperatura ambiente dopo la stimolazione. Rimuovere la soluzione stimolante e immergere la piastra con il drosophila fissato. Eseguire la preparazione in un becher riempito con 100 millilitri di soluzione salina per drosophila due volte per rimuovere il colorante extracellulare FM 1-43 lavorando sotto cappa chimica.

Fissare il preparato della giunzione neuromuscolare con glutaraldeide al 2,5% in soluzione salina tamponata al fosfato o PBS per 45 minuti a temperatura ambiente. Lavare il preparato una volta con PBS, quindi rimuoverlo dalla capsula e immergerlo in cloruro di ammonio 100 millimolare per 15 minuti, al fine di eliminare i gruppi aldeidici liberi del fissativo glutaraldeide residuo.

Utilizzando PBS normale, lavare la soluzione di cloruro di ammonio, posizionare il preparato della giunzione neuromuscolare in una nuova capsula Petri e immergerlo in 1,5 milligrammi per millilitro filtrato di diammina benzidina o DAB in PBS e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Posizionare il campione sotto un microscopio a fluorescenza dotato di sorgente luminosa a lampada al mercurio con alloggiamento della lampada contenente uno specchio posteriore, utilizzando un obiettivo secco a ingrandimento relativamente basso.

Trova il campione. Quindi, utilizzando un normale cubo filtro con eccitazione blu e fluorescenza verde, metti a fuoco il segnale fluorescente. Le giunzioni neuromuscolari appaiono come punti luminosi sui muscoli.

Successivamente, utilizzando lo stesso set di filtri per fluorescenza, illuminare il campione all'intensità massima fino a quando il FM D non sarà completamente sbiancato. Utilizzando un obiettivo 20x, dovrebbero essere sufficienti da 30 a 45 minuti. Tuttavia, il tempo necessario per la fotoconversione varia in base all'intensità dell'illuminazione, alla capacità di penetrazione del DAB nel preparato e all'obiettivo utilizzato.

Dopo l'illuminazione, esaminare il campione in luce trasmessa. Se la fotoconversione ha avuto luogo, dovrebbe essere visibile un precipitato marrone scuro. Tornare al microscopio stereoscopico, quindi utilizzare le forbici per tagliare la zona fotoconvertita dalla larva.

Ritorna al microscopio per dissezioni. Quindi utilizza le forbici per tagliare la zona fotoconvertita dalle larve. Ora posiziona il campione in una provetta microcentrifuga contenente PBS, operando sotto cappa chimica e indossando idonei dispositivi di protezione, inclusi guanti e protezione oculare.

Preparare 300 microlitri di tetroxido di osmio al 1% per campione. Posizionare ora il campione in un flacone di vetro con tappo di plastica e aggiungere la soluzione di tetroxido di osmio preparata per la postfissazione del campione. Mentre il campione è in incubazione, preparare soluzioni separate contenenti etanolo al 30, 50, 70, 90, 95 e 100%.

Lavare il campione da quattro a cinque volte con PBS per cinque minuti ciascuna. Dopo ogni lavaggio, utilizzare un PE di plastica sul proprio pipetto per trasferire il campione in un nuovo flacone. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il campione in un flacone di vetro pulito.

Successivamente, disidratare il campione ponendolo in una serie di soluzioni di etanolo. Iniziare incubando in un millilitro di etanolo al 30%. Dopo cinque minuti, rimuovere l'etanolo utilizzando una pipetta Pasteur e sostituirlo con un millilitro di etanolo al 50%.

Proseguire con la disidratazione, incubando il preparato della giunzione neuromuscolare nelle soluzioni al 70, 90 e poi al 95%. Il campione verrà quindi incubato nella soluzione di etanolo al 95% per un numero maggiore di volte rispetto all'incubazione nell'etanolo al 100% effettuata tre volte dopo la disidratazione. Aggiungere due millilitri di resina EIN in rapporto uno a uno con l'etanolo e posizionare il campione su un agitatore rotante per l'incubazione.

Due a quattro ore a temperatura ambiente dopo la rotazione al 100%ein e posizionare il campione in un becher aperto per permettere all'etanolo residuo di evaporare per quattro a sei ore. Versare EIN fresco in uno stampo. Aggiungere i preparati e incubare a 60 gradi Celsius per 36 ore.

Quando i preparati inclusi con EIN sono pronti, utilizzare un ultramicrotomo per preparare sezioni sottili di 50-80 nanometri I con un coltello al diamante. I campioni vengono tagliati in sezioni sottili. Le sezioni galleggiano sul bagno d'acqua del coltello e successivamente possono essere raccolte su normali griglie per microscopia elettronica.

Le preparazioni sono ora pronte per essere analizzate mediante procedure convenzionali di microscopia elettronica. Le giunzioni neuromuscolari isolate da Drosophila Melanogaster sono state stimolate utilizzando potassio ad alta concentrazione e le membrane internalizzate sono state colorate con FM 1-43, come mostrato qui.

La fluorescenza di un terminale nervoso può essere osservata utilizzando un microscopio a fluorescenza episcopica convenzionale. Sotto illuminazione continua, il colorante viene completamente sbiancato e, quando l'illuminazione prosegue, appare un colore nero a causa della precipitazione del dino benzene. Questo terminale nervoso contiene vescicole sinaptiche, ma nessuna di esse è stata fotoconvertita.

Questo potrebbe essere causato da un'illuminazione insufficiente o da una scarsa penetrazione del benzina amino DIA nel tessuto. Al contrario, un'eccessiva illuminazione provoca un terminale complessivamente scuro in cui non è possibile distinguere vescicole o organelli; con la giusta quantità di illuminazione, è possibile osservare la fotoconversione. Questo micrografo mostra un boccone sinaptico in cui è visibile un accumulo di vescicole scure, indicativo della fotoconversione FM.

Abbiamo appena mostrato come fotoconvertire vescicole sinaptiche marcate con fem die. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di calibrare sempre attentamente i tempi di illuminazione per il passaggio di conversione. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato. Buona fortuna con i vostri esperimenti.