Completa l'analisi della composizione delle pareti cellulari delle piante (biomassa lignocellulosica) Parte II: Carboidrati

La determinazione della composizione in polisaccaridi della matrice e del contenuto di cellulosa cristallina nelle pareti cellulari vegetali inizia con materiale vegetale essiccato, al quale vengono sottoposti diversi estratti. Il materiale ottenuto è costituito esclusivamente da pareti cellulari, che vengono poi frazionati per determinarne la composizione in polisaccaridi della matrice. Il materiale delle pareti viene trattato con un acido debole per idrolizzare i polisaccaridi non cristallini, principalmente le emicellulose, nei rispettivi monosaccaridi.

I monosaccaridi vengono quindi derivati nei corrispondenti aldolo acetati volatili, che vengono successivamente analizzati e quantificati mediante cromatografia gassosa abbinata a uno spettrometro di massa per la determinazione della cellulosa cristallina. Le pareti cellulari vengono trattate con il reagente grafico, una miscela di acidi che rimuove i componenti non cristallini della parete. La cellulosa cristallina residua viene degradata nel suo monomero glucosio, che può essere dosato colormetricamente.

La determinazione del contenuto e della composizione della lignina è illustrata in un'altra pubblicazione video di J intitolata Analisi Compositiva Completa delle Pareti Cellulari delle Piante, Parte Prima Lignina. Ciao, sono Marcus Pauley, responsabile della struttura analitica per lo studio della parete cellulare presso il Great Lakes Bioenergy Research Center della Michigan State University. Sono Cliff Foster, responsabile della struttura analitica per lo studio della parete cellulare.

Oggi vi mostreremo come determinare la composizione dei polisaccaridi presenti nel materiale della parete cellulare vegetale, ovvero la cellulosa in varie omo-cellulose. Qui presso il Great Lakes Bioenergy Research Center sviluppiamo tecnologie per convertire questi zuccheri in biocarburanti. Per identificare una materia prima vegetale ottimale, dobbiamo prima valutare il tipo e l'abbondanza di zuccheri presenti in questa biomassa.

In un altro video intitolato Analisi Compositiva Completa delle Pareti Cellulari delle Piante, parte uno Lignina, ci concentreremo sull'analisi dei polifenoli. Cominciamo. Iniziare questa procedura isolando le pareti cellulari.

Macinare circa 60-70 milligrammi di materiale vegetale secco con sfere di acciaio inossidabile da 5,5 millimetri in un tubo a vite SAR TED da due mil. Utilizzando un mulino REM come alternativa ad alto rendimento, impiegare un robot per la macinazione e la dispensazione denominato eyewall, come descritto nella prima parte. Al termine della macinazione, rimuovere le sfere di acciaio.

Continuare a isolare le pareti cellulari e rimuovere l'amido residuo come mostrato nella prima parte e descritto nel protocollo scritto allegato. Pesare due milligrammi di materiale di parete cellulare di amido DS in un tubo da due millilitri. Un metodo ad alto rendimento per eseguire questa operazione è il robot eyewall.

Il robot prende un tubo contenente materiale vegetale macinato e pratica un foro nella parte inferiore del tubo. Il tubo forato viene quindi posizionato su un alimentatore VI. Un tubo vuoto viene posto su una bilancia e spostato sotto l'alimentatore VI; attraverso la vibrazione, il materiale percola attraverso il foro nel tubo superiore caricato e cade nel tubo inferiore vuoto fino al raggiungimento della quantità desiderata di materiale.

Aggiungere 100 microgrammi di acetolo come standard interno. Risciacquare le pareti del tubo con acetone per raccogliere il materiale della parete cellulare sul fondo del tubo ed evaporare delicatamente l'acetone sotto flusso d'aria. Successivamente, eseguire l'idrolisi con acido debole.

Aggiungere con attenzione 250 microlitri di acido tricloroacetico due molare o TFA a ciascun campione, avendo cura che nessun materiale schizzi sulle pareti dei tubi. Chiudere ermeticamente i tubi e incubare a 121 gradi Celsius in un blocco riscaldante per 90 minuti. Successivamente, raffreddare i blocchi riscaldanti e i campioni su ghiaccio e centrifugare i tubi a 10.000 giri al minuto per 10 minuti.

Trasferire 100 microlitri del surnatante acido contenente gli zuccheri solubilizzati del polisaccaride della matrice in vial con tappo a vite, avendo cura di non disturbare il materiale del pellet. Il pellet può essere utilizzato per il saggio della cellulosa cristallina. Evaporare il TFA in un tubo di vetro sotto un flusso delicato di aria in un dispositivo di evaporazione.

Aggiungere 300 microlitri di due propanolo per rimuovere l'eccesso di acido; vortexare ed evaporare a 25 gradi Celsius. Ripetere per un totale di tre volte. Per consentire l'identificazione dei monosaccaridi mediante cromatografia gassosa, eseguire una derivatizzazione in aldotriacetato.

Prima di tutto, ridurre i monosaccaridi nei corrispondenti aldoli a catena aperta, che vengono quindi acetilati. Consultare il protocollo scritto allegato per istruzioni dettagliate. Ogni passaggio della procedura segue il protocollo precedentemente descritto, con aggiunta del reagente, incubazione ed evaporazione sotto flusso di aria, seguita dalla rimozione dell'eccesso di reagente mediante diversi passaggi di lavaggio.

Nelle fasi finali, si estraggono gli acetati aldolici. Aggiungere prima 500 microlitri di acetato di etile e agitare leggermente. Quindi aggiungere due millilitri di acqua, chiudere i tubi con tappo e vortexare; centrifugare i tubi a 2000 giri/min per cinque minuti per ottenere strati separati e chiari, con l'acetato di etile nella parte superiore contenente gli acetati di Al Dettol e l'acqua nella parte inferiore. Pipettare 50 microlitri dello strato di acetato di etile in vial per GCMS con inserti; diluire aggiungendo 100 microlitri di acetone al vial per GC, che può essere conservato a quattro gradi Celsius.

Se l'analisi GCMS non viene eseguita immediatamente, iniettare i campioni in un gascromatografo dotato di spettrometro di massa a quadrupolo. Per quanto riguarda la colonna e i dettagli della corsa, consultare il protocollo scritto allegato. Il materiale di partenza per la determinazione del contenuto di cellulosa cristallina può essere materiale di parete cellulare isolato oppure materiale di parete già trattato con l'acido debole TFA, sia immediatamente dopo il trattamento acido che in forma essiccata conservabile.

Dopo aver rimosso l'eccesso di TFA con isopropanolo come mostrato in precedenza, aggiungere al pellet di TFA nei due M sars il reagente up degra in un volume di un M, costituito da acido acetico, acido nitrico e acqua, in un rapporto volumetrico di otto a uno a due. Chiudere ermeticamente il tubo, vortexare e riscaldare su un blocco termico a 100 gradi Celsius per 30 minuti. A seguito di questo trattamento, solo la cellulosa cristallina rimane nel pellet.

Tutti gli altri polisaccaridi vengono idrolizzati in campioni freddi nel blocco su ghiaccio fino a temperatura ambiente o più bassa. Successivamente, centrifugare i campioni a 10.000 RPM per 15 minuti; dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante assicurandosi che il pellet non venga disturbato e che nessun materiale del pellet venga rimosso. A tale scopo, lasciare circa 150 microlitri di soprannatante nel tubo e lavare il pellet più volte con acqua.

Successivamente, eseguire un'ulteriore idrolisi con acido solforico concentrato al fine di idrolizzare completamente il pellet cristallino e la cellulosa in glucosio. Iniziare aggiungendo 175 microlitri di acido solforico al 72% al tubo sarta e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione iniziale, vortexare il campione e incubare per altri 15 minuti.

Quindi aggiungere 825 microlitri di acqua e vortexare e centrifugare i campioni a 10.000 giri/min per cinque minuti. Potrebbe essere presente del materiale marrone e solubile, principalmente lignina, che rimane nel tubo, mentre il glucosio si trova nel sopranatante. Il contenuto di glucosio nel sopranatante viene analizzato mediante saggio colorimetrico con anthone.

Questo saggio viene eseguito in una piastra microtiter in polistirene da 96 pozzetti. Preparare una curva standard di glucosio in duplicato seguendo le istruzioni riportate nel protocollo scritto allegato. Preparare i campioni mescolando 10 microlitri di ciascun campione, sopranatante, e 90 microlitri di acqua in pozzetti separati della stessa piastra microtiter; completare aggiungendo 200 microlitri di reagente appena preparato e omogeneizzato.

Successivamente, riscaldare la piastra per 30 minuti a 80 gradi Celsius in un forno con un dissipatore di calore in alluminio. Osservare che i campioni contenenti glucosio passano dal giallo al verde bluastro al termine del riscaldamento. Lasciare raffreddare la piastra a temperatura ambiente e agitare accuratamente.

Leggere l'assorbanza a 625 nanometri utilizzando un lettore per piastre microtitolazione. Il contenuto di glucosio, il mattone costitutivo della cellulosa, viene calcolato in base all'assorbanza rispetto alla curva standard stabilita sulla stessa piastra. Di seguito sono riportati alcuni risultati rappresentativi dell'analisi dei polisaccaridi di un campione di legno di pioppo.

I picchi del cromatogramma gassoso vengono identificati in base ai profili di massa e/o ai tempi di ritenzione degli standard. I monosaccaridi vengono quantificati in base a curve di calibrazione. L'analisi degli zuccheri nei polisaccaridi della matrice mostra un'elevata abbondanza di xilosio, rappresentativo dell'emice llulosa xam, ma sono presenti anche altri zuccheri.

Secondo l'analisi, il 40% del materiale di pioppo è costituito da cristalli e cellulosa. Si noti che questi contenuti e composizioni possono variare da pianta a pianta o tra diverse anatomie vegetali. Abbiamo appena mostrato come determinare il contenuto di polisaccaridi e l'analisi composizionale della biomassa lignocellulosica per l'analisi della lignina polifenolica.

Sintonizzati sulla prima parte. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.