Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Questo protocollo utilizza un promotore regolabile che consente un'espressione controllata delle proteine. In questo esperimento, utilizziamo un plasmide two micron ad alta copia che esprime il dominio N da un promotore reprimibile dal metionina. Le cellule di lievito di tipo selvaggio vengono trasformate con questo plasmide.

I plasmidi e i trasformanti vengono selezionati su piastre prive di uol. Dopo una crescita notturna, le cellule nei mezzi selettivi vengono sincronizzate mediante arresto della crescita mediato dall'assenza di cortisolo.

Infine, l'espressione viene indotta trasferendo le cellule in un mezzo privo di metionina durante l'esperimento nel tempo. La concentrazione proteica viene monitorata mediante western blotting e lo sviluppo del fenotipo morfologico mediante microscopia. Ciao, sono Claudia del Dipartimento di Scienze Biologiche della Purdue University.

Sono de Bari Muji nell'alar e sono anche nel laboratorio AL. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico in funzione della concentrazione proteica nel corpo induttore. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare gli aspetti morfologici e molecolari di un fenotipo di divisione cellulare osservato in seguito alla sovraespressione del dominio N due della proteina adattatrice endocitica assente due.

Iniziamo. Questo protocollo inizia con la costruzione di un ceppo di lievito che esprimerà la proteina di interesse. Nel nostro caso, abbiamo trasformato il ceppo di lievito di tipo selvaggio W 3 0 3 con un DNA plasmidico ad alta copia contenente nth due sotto il controllo del promotore reprimibile da metionina; 2 millimolar di metionina sopprime l'attività del promotore met 25.

Sebbene un mezzo privo di metionina consenta un'espressione massima, selezionare sei colonie da una piastra contenente cellule recentemente trasformate e inoculare in 50 millilitri di mezzo selettivo con 0,2 millimolari di metionina in un pallone conico, incubare tutta la notte a 30 gradi Celsius con agitazione a 200 giri al minuto; il mattino seguente stimare la densità cellulare misurando la densità ottica della coltura a 600 nanometri. Trasferire l'equivalente di 20 OD a 600 nanometri per millilitro di cellule in un tubo da centrifuga sterile ed effettuare la raccolta mediante centrifugazione.

Risospendere le cellule in mezzo YPD mediante vortex per sincronizzare il ciclo cellulare fino a una concentrazione finale di 15 microgrammi per millilitro a partire da una soluzione madre di un milligrammo per millilitro in DMSO. Incubare per quattro ore a 30 gradi Celsius con agitazione a 200 giri al minuto. Dopo quattro ore, verificare la percentuale di cellule arrestate in mitosi.

Osservando al microscopio e contando il numero di cellule con gemme di dimensioni uguali, procedere al passaggio successivo. Raccogliere le cellule solo se l'arresto è superiore al 90%, mediante centrifugazione a 2200 giri al minuto per cinque minuti. Dopo tre lavaggi con acqua fredda, risospendere il pellet in un mezzo selettivo privo di metionina a una densità cellulare di circa 0,5 OD a 600 nanometri per millilitro.

Trasferire metà del volume delle cellule in un nuovo tubo sterile e aggiungere metionina fino a una concentrazione finale di 0,2 millimolari. Questo servirà come controllo per gli effetti dovuti ai livelli basali di espressione proteica. Reintrodurre entrambe le colture nell'incubatrice a 30 gradi Celsius.

Le cellule vengono analizzate per lo sviluppo del fenotipo ogni ora per sei ore a ogni tempo. Prelievo di un millilitro di sospensione cellulare di ciascuna coltura e trasferimento in un tubo microfuga sterile, quindi raccolta delle cellule mediante centrifugazione, asportazione del sopranatante e risospensione del pellet in 70 microlitri di mezzo. Successivamente, aggiungere 30 microlitri di blu di metilene da una soluzione madre di un milligrammo per millilitro in acqua sterile.

Successivamente, pipettare circa sei microlitri di questa sospensione su un vetrino pulito e posizionare un coprioggetto sulla goccia. Premere delicatamente il coprioggetto per formare uno strato sottile e uniforme di cellule tra le superfici di vetro. Dividere il coprioggetto in nove quadranti ed acquisire tre immagini per quadrante.

Il numero di cellule per campo non deve superare le 30 cellule, per consentire una quantificazione accurata. Contare il numero di cellule che mostrano il fenotipo oggetto dello studio, che in questo esempio sono cellule di lievito in gemmazione con gemme allungate e/o concatenate che non riescono a separarsi l'una dall'altra. Contiamo inoltre il numero di cellule morte, identificate dal loro colore blu, poiché il difetto di divisione cellulare indotto in seguito a nth.

L'overespressione porta alla morte cellulare per visualizzare difetti fenotipici specifici in ogni momento. Prelieva un'aliquote di un millilitro di coltura in una provetta microcentrifuga sterile e raccogli le cellule mediante centrifugazione. Sospendi il pellet cellulare in 100 microlitri di soluzione Calcofluor White ad un milligrammo per millilitro in acqua sterile e incuba per cinque minuti a temperatura ambiente al buio.

La colorazione con calcior bianco permette la visualizzazione della parete cellulare. Lavare il pellet tre volte con un volume equivalente di PBS. Sospendiamo il pellet finale in 100 microlitri di PBS.

Osservare le cellule al microscopio ed acquisire immagini a 100 x di ingrandimento utilizzando ottiche UV per visualizzare la parete cellulare. Per visualizzare la settina marcata con GFP, acquisire immagini utilizzando un filtro FS E. Quantificare la percentuale di cellule con difetti della parete cellulare e con mallocalizzazione della settina utilizzando il metodo mostrato in precedenza, dividendo il vetrino in nove quadranti ed acquisendo tre immagini per quadrante per il conteggio del video in time-lapse. La microscopia di singole cellule di lievito richiede letti di agarosio con mezzo incorporato per preparare un letto di agarosio.

Pulire innanzitutto un vetrino con depressione concava utilizzando alcol al 70% e lasciarlo asciugare all'aria mentre il vetrino si asciuga. Far bollire 0,06 grammi di agros in cinque millilitri di terreno selettivo privo di metionina in un forno a microonde fino a quando l'agros si dissolve completamente e rapidamente. Pipettare 200 microlitri del terreno contenente agros nel vetrino.

Appoggiare e capovolgere un altro vetrino pulito sopra di esso, assicurandosi che non rimangano bolle d'aria intrappolate al di sotto. Quando il gel si è solidificato, spostare con delicatezza il vetrino superiore lontano dal vetrino con cavità, mantenendo sempre le loro superfici parallele. Ciò garantisce che la superficie del letto di agarosio sia perfettamente allineata con la superficie del vetrino con cavità.

Pulire la zona del vetrino circostante il letto di agros con un tessuto delicato. Il vetrino è ora pronto per l'uso a tempo pari a quattro ore. Trasferire un millilitro di cellule dalla coltura in una provetta microfuga sterile e raccoglierle mediante centrifugazione.

Aspirare il sovranatante e risospendere le cellule in 100 microlitri di mezzo selettivo fresco privo di metionina. Applicare vaselina ai bordi del vetrino. Quindi posizionare una goccia di sospensione cellulare al centro del letto di agarosio e distribuirla uniformemente premendo delicatamente un vetrino al di sopra.

Sigillare i bordi del vetrino e fissarne la posizione applicando dello smalto per unghie lungo i margini. Una volta che lo smalto è asciutto, posizionare il vetrino su un palchetto riscaldato del microscopio. Utilizziamo un microscopio Zeiss Axio 200 M dotato di una telecamera digitale monocromatica Zeiss Axio cam MRM per selezionare un campo che contenga non più di 10 cellule adeguatamente distanziate, poiché il campo tenderà a riempirsi nel tempo.

Mentre le cellule si dividono, acquisire un'immagine del campo ogni cinque minuti per circa cinque ore. Per evitare di dover regolare ripetutamente la messa a fuoco, programmiamo il software di acquisizione delle immagini per acquisire automaticamente alcune immagini Zack in ogni punto temporale.

L'immagine con la messa a fuoco migliore verrà selezionata in un secondo momento per l'assemblaggio del filmato, al fine di garantire un riscaldamento adeguato per le cellule; come fonte di calore esterna, oltre ai piatti riscaldati, si può lasciare accesa la luce bianca trasmessa del microscopio per tutta la durata dell'acquisizione. La regressione del fenotipo può essere studiata assemblando le immagini in un filmato mediante il software Image J. Qui mostriamo risultati rappresentativi dell'iperespressione della nostra proteina di interesse. Nth due.

Prima di tutto, l'espressione proteica di nth due. Durante il corso temporale dell'esperimento, i lisati ottenuti da cellule che esprimono HA-nth due sono stati analizzati mediante immunoblotting utilizzando un anticorpo monoclonale anti-HA; come mostrato dall'immunoblot, le cellule cresciute in presenza di 0,2 millimolari di metionina presentano un'espressione proteica minima. Tuttavia, le cellule cresciute in mezzo privo di metionina mostrano un aumento costante della concentrazione di S due nel corso temporale dell'esperimento.

Successivamente, le cellule coltivate in presenza o assenza di metionina per sei ore sono state analizzate, poiché una bassa concentrazione di nth due non è in grado di indurre un fenotipo di divisione cellulare o la morte cellulare esclusivamente. Una bassa percentuale di cellule è morta, come indicato dal loro colore blu dopo la colorazione con blu di metilene. Analogamente, il numero di nuclei per cellula, l'organizzazione della parete cellulare e dei settini sono normali, come previsto.

Invece, la sovraespressione di M due provoca un grave difetto nella divisione cellulare e morte cellulare, come dimostrato da lunghe catene di gemme allungate e connesse che mantengono il colore blu dopo colorazione con blu di metilene. La maggior parte delle cellule fenotipiche è multinucleata, come indicato dalla colorazione con DPI. La colorazione con Calcoflour bianco evidenzia accumuli di placche anomale della parete cellulare.

Inoltre, la settina è gravemente mallocalizzata e disorganizzata. La quantificazione del fenotipo in funzione del tempo è mostrata in questo grafico, in cui i cerchi aperti rappresentano metionina a zero millimolare e i cerchi chiusi rappresentano metionina a 0,2 millimolare. Si osserva che, all'aumentare della concentrazione di nth due all'interno delle cellule nel tempo, aumenta anche la percentuale di cellule che mostrano il fenotipo di divisione cellulare.

Le cellule di controllo coltivate in 0,2 milli di metionina mostrano che lo sviluppo del fenotipo dipende da un'elevata concentrazione proteica e non dalle condizioni di coltura cellulare. Infine, lo sviluppo del fenotipo in seguito alla sovraespressione di nth2 viene registrato mediante microscopia video a intervalli di tempo.

Dopo quattro ore di nth, due cellule con sovraespressione mostrano un lieve fenotipo morfologico di divisione cellulare. Procedendo nel filmato, osserviamo periodi anomali e prolungati di crescita del germoglio apicale, che danno origine a germogli molto allungati. Osserviamo inoltre l'emergere di nuovi germogli prima che abbia luogo un evento di separazione cellulare.

Inoltre, si osserva che i germogli emergono da diverse regioni della cellula madre, dando origine a un aspetto ramificato. Vi abbiamo appena mostrato come caratterizzare e analizzare lo sviluppo di un fenotipo morfologico in funzione della concentrazione proteica nel lievito in gemmazione. Eseguendo questa procedura, è importante ricordare di risospendere le cellule alle velocità di centrifugazione raccomandate, poiché velocità più elevate potrebbero danneggiare le cellule.

È inoltre importante ricordare di aggiungere il blu di metilene e il cloruro immediatamente prima dell'acquisizione delle immagini, poiché sono tossici per le cellule light east. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.