Basati sul DNA Fish Identification Specie protocollo

Il Sistema di Identificazione delle Specie Ittiche è un metodo semplice, rapido e accurato basato sul DNA per identificare le specie ittiche presenti in un campione specifico. I campioni di pesce vengono trattati con proteinasi K per rilasciare gli acidi nucleici in soluzione. Il DNA genomico del pesce viene quindi isolato e amplificato mediante PCR utilizzando primer che si legano a sequenze presenti in tutti i genomi dei pesci.

I prodotti PCR vengono quindi digeriti con tre diversi enzimi di restrizione e separati mediante bioanalizzatore Agilent 2100. Le lunghezze dei frammenti prodotti nelle reazioni di digestione possono essere utilizzate per determinare la specie del pesce mediante software di confronto dei profili di polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione, o RFLP. Ciao, sono Rachel Formosa di Agilent Technologies.

Oggi vi mostreremo un procedimento per l'identificazione delle specie ittiche basato sul DNA. Questo procedimento è un metodo di screening che consente di identificare le specie di pesce presenti in campioni freschi, congelati, tritati, cotti, essiccati o comunque trasformati. E ciò può essere realizzato in meno di una giornata lavorativa.

Utilizziamo questo procedimento per studiare l'autenticità dei prodotti ittici, un aspetto molto importante per l'industria ittica poiché la sostituzione e l'etichettatura errata possono avere significative conseguenze economiche, ambientali e relative alla sicurezza alimentare. Inoltre, può essere particolarmente difficile determinare la specie del pesce mediante identificazione visiva e altri metodi tradizionali. Una volta che un pesce è stato lavorato, l'analisi del DNA fornisce un risultato molto più accurato e affidabile.

Iniziamo. Preparare i campioni per l'estrazione del DNA posizionando da 10 a 1000 milligrammi di ciascun campione di tessuto di pesce crudo o cotto in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri per ogni pesce. Aggiungere 220 microlitri di soluzione di proteinasi K appena preparata e pipettare su e giù.

Incubare i tubi a 65 gradi Celsius per 10 minuti; dopo l'incubazione, centrifugare per tre-cinque minuti a 14.000 G per formare un pellet dei tessuti non digeriti. Successivamente, trasferire con attenzione 150 microlitri di ciascun sopranatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitro, evitando qualsiasi materiale non digerito sul fondo e il materiale oleoso presente in superficie. Il sopranatante verrà ora utilizzato per l'estrazione del DNA genomico.

Iniziare l'estrazione del DNA genomico aggiungendo 500 microlitri del tampone di legame degli acidi nucleici a ciascun campione. Questo porterà il volume totale del campione a 650 microlitri. Vortexare il campione fino a completa omogeneizzazione.

Successivamente, trasferire ogni campione in una colonna di legame per DNA posizionata in uno dei due tubi raccoglitori da un millilitro forniti nel kit. Chiudere saldamente il cappuccio del tubo sulla parte superiore della colonna. Centrifugare i campioni per un minuto a 14.000 G per far legare il DNA alla matrice della colonna.

Dopo la centrifugazione, rimuovere le provette da centrifuga, scartare il filtrato e riposizionare le provette nei tubi raccoglitori. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio ad alta salinità 1x. Chiudere i tubi con il cappuccio e centrifugare nuovamente dopo la centrifugazione.

Scartare il filtrato e riposizionare nuovamente le spin cup nei tubi raccoglitori. Aggiungere ora 500 microlitri di etanolo al 80%. Chiudere il tubo con il cappuccio e centrifugare a 14.000 G per un minuto.

Ripetere il lavaggio con etanolo altre due volte dopo il terzo lavaggio in etanolo al 80%, quindi scartare i filtrati. Riposizionare le spin cup nei tubi raccoglitori e, questa volta, centrifugare per due minuti per asciugare la matrice di fibre. Trasferire ora le spin cup in tubi di raccolta da 1,5 millilitri.

Aggiungere 100 microlitri di buffer di eluizione direttamente su ogni spin cup, posizionandoli sulla matrice di fibra all'interno della cup. Quindi chiudere con uno scatto i tappi dei tubi di raccolta sulle spin cup e incubare a temperatura ambiente per un minuto. Al termine dell'incubazione, centrifugare i campioni alla velocità massima per un minuto.

Successivamente, scartare la provetta da centrifuga e chiudere le provette con il tappo. Se si misurano le concentrazioni di DNA, ci si aspetta un intervallo compreso tra cinque nanogrammi per microlitro e 500 nanogrammi per microlitro. Il DNA può ora essere conservato a quattro gradi Celsius per un periodo massimo di un mese; per la conservazione a lungo termine, collocare il DNA a meno 20 o meno 80 gradi Celsius.

Eseguire la PCR utilizzando i primer e i reagenti forniti nel kit di reagenti P-C-R-R-F-L-P. Secondo il protocollo scritto allegato, si raccomanda di eseguire ogni campione, inclusi il controllo positivo e il controllo senza stampo, in duplicato durante l'esecuzione della PCR. Preparare le miscele master degli enzimi di restrizione per le digestioni con DTE E one HAE three e NL three combinando i seguenti componenti nell'ordine indicato: 1,5 microlitri di acqua distillata sterile, 0,5 microlitri di buffer enzimatico 10x e 0,5 microlitri di enzima 10x.

Preparare una quantità sufficiente per tutti i campioni più un volume di reazione in eccesso del reagente misto quattro per tre. Quindi distribuire 2,5 microlitri in ogni provetta di reazione etichettata con il nome del campione e dell'enzima. Al termine della PCR, rimuovere i campioni dal termociclatore e posizionarli sul ghiaccio.

Aggiungere 2,5 microlitri di ciascun prodotto PCR in ciascuna delle tre provette per la digestione con enzimi di restrizione corrispondente alla reazione: DDE uno HAE tre e NLA tre. Successivamente, vortexare.

Centrifugare brevemente e incubare le digestioni a 37 gradi Celsius per due ore. Se più comodo, le digestioni possono anche essere incubate tutta la notte. Al termine della digestione, incubare le reazioni a 65 gradi Celsius per 15 minuti.

Quindi aggiungere un microlitro di EDTA 60 millimolare in ogni provetta per terminare la reazione e vortexare. Utilizzando il kit di reagenti Agilent Bioanalyzer, preparare e caricare la digestione con enzimi di restrizione nei pozzetti di un chip DNA seguendo le istruzioni del kit. Per ogni campione, tutti e tre i digesti devono essere caricati sullo stesso chip.

Quindi vortexare il chip e caricarlo nella macchina. Al termine della corsa, accedere al contesto del saggio e selezionare la scheda riepilogo del chip. Nel campo nome del campione, inserire un nome del campione per tutte e 12 le pozzette del chip per identificare la specie di pesce dei campioni di DNA in esame.

Avviare il programma di decodifica RFLP facendo clic su file. Quindi aprire il file XAD. Si aprirà la finestra di dialogo di apertura.

Ora selezionare il file XAD per il chip di DNA utilizzato. Fare clic su "apri" per visualizzare un elenco dei campioni caricati sul chip. Selezionare i tre digest corrispondenti al primo campione di DNA.

Nella colonna enzima, specificare gli enzimi di restrizione utilizzati nel campo denominato altezza minima del picco come percentuale del marcatore inferiore. Il valore predefinito è 10%, se necessario. Questo valore può essere ridotto per identificare picchi piccoli che sono stati trascurati oppure aumentato per eliminare picchi derivanti da rumore non specifico nell'elettroferogramma.

Dopo aver apportato eventuali modifiche al valore minimo dell'altezza dei picchi, fare clic su reintegra. A questo punto, fare clic su calcola nella parte inferiore della finestra di dialogo. I dati sulla lunghezza dei frammenti ottenuti dall'analisi con il bioanalyzer verranno inseriti nei campi del software.

Successivamente, nella lista a discesa del punteggio nell'angolo in alto a sinistra dello schermo, selezionare dado. Se il campione di pesce consiste in una singola specie di pesce o in una miscela, e se il campione potrebbe consistere in una miscela, la tabella nella parte inferiore dello schermo, etichettata come elenco dei punteggi combinati, mostra le corrispondenze migliori per specie in base ai risultati di tutte e tre le reazioni di digestione.

Le corrispondenze perfette con un punteggio di uno sono evidenziate in verde. Le corrispondenze approssimate sono evidenziate in giallo nella parte superiore dello schermo. Il valore di soglia inferiore indica la dimensione minima del frammento utilizzata nell'analisi, mentre il valore di tolleranza di corrispondenza determina quanto deve essere simile in lunghezza un frammento a quello previsto per essere considerato una corrispondenza.

I valori mostrati sono le impostazioni predefinite e possono essere modificati. Ripetere questi passaggi per l'analisi dei campioni di DNA rimanenti sulla punta. Campioni di DNA di quattro specie diverse di pesci sono stati isolati, amplificati e digeriti utilizzando il metodo descritto in questo video.

Un gel di bioanalizzatore che mostra i campioni di digestione con enzimi di restrizione è riportato qui utilizzando l'Agilent Bioanalyzer e il decodificatore RFLP. I modelli di profilo software vengono utilizzati per identificare il pesce. Il primo campione viene correttamente identificato come trota, il secondo come tonno, il terzo come pesce persico.

E l'ultimo campione come merluzzo specifico. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire l'identificazione delle specie di pesce basata sul DNA utilizzando il metodo P-C-R-R-F-L-P di Agilent. Quando si esegue questa procedura, è importante evitare la contaminazione incrociata dei campioni poiché il metodo è molto sensibile.

Ecco fatto. Ora sapete come identificare rapidamente, facilmente e con precisione le specie di pesce presenti nei vostri campioni. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.