Scatter microscopia ottica Sulla base bidimensionale Filtri di Gabor

In questo video, la microscopia a dispersione ottica viene utilizzata per quantificare la frammentazione mitocondriale durante l'apoptosi. Sebbene la microscopia a dispersione ottica normalmente non richieda fluorescenza in questo protocollo, verranno acquisite immagini fluorescenti a scopo di validazione. Dopo aver configurato il sistema di acquisizione immagini, le cellule vengono marcate con MIT tracker green e trattate con stor sporin per indurre l'apoptosi.

I dati ottici vengono acquisiti per rilevare cambiamenti nell'orientamento degli organelli cellulari entro due ore. L'inizio della frammentazione mitocondriale può essere misurato utilizzando i dati di scattering ottico, che mostrano una riduzione del grado di orientamento delle particelle subcellulari. I dati vengono quindi convalidati correlando i dati di scattering ottico con le regioni fluorescenti contenenti mitocondri.

Ciao, sono Nada Bustani del Laboratorio di Bio-ottica del Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Rutgers University. Sono Rob Pak del Laboratorio di Bio-ottica, e sono Deen, anch'io del Bio Lab. Oggi vi mostreremo un procedimento per quantificare la dinamica morfologica subcellulare mediante un metodo che non si basa su coloranti fluorescenti.

Utilizziamo questa tecnica nel nostro laboratorio per studiare i cambiamenti dinamici della struttura subcellulare durante l'apoptosi o la morte cellulare programmata. Cominciamo dunque. Iniziare la procedura sterilizzando le mani guantate con etanolo al 70%.

Quindi posizionare una soluzione madre pronta da 100 nanomolari di miot tracker green e il mezzo di coltura cellulare BAEC preriscaldato nell'incubatore a luce spenta e sterilizzare tutte le superfici. Successivamente, posizionare una piastra da coltura a sei pozzetti con cellule seminate su coprivetrino sotto l'incubatore. Utilizzando una pipetta Pasteur collegata a una linea di vuoto.

Rimuovere il mezzo cellulare dai pozzetti. Quindi aggiungere immediatamente due millilitri del mezzo marcato in ciascun pozzetto per etichettare le cellule.Mitochondria. Coprire la piastra per colture cellulari per evitare l'esposizione alla luce diretta dell'ambiente e reinserire rapidamente le cellule nell'incubatore.

Incubare per 45 minuti a 37 gradi Celsius mentre le cellule incubano. Preparare prima l'impostazione ottica accendendo la lampada a arco di mercurio. Quindi accendere i computer, le telecamere del microscopio e il laser, collegando il dispositivo microelettromeccanico digitale o DMD nel diffusore rotante.

Successivamente, osservare attraverso l'oculare del microscopio per verificare se il lancio ottico è allineato. Il campo visivo dovrebbe essere illuminato uniformemente dalla luce laser. Per caricare il campione, posizionare una o due piccole gocce di olio di immersione su un obiettivo a immersione in olio da 63 x mentre si trova nella posizione più bassa.

Quindi, montare sulla piastra un vetrino costituito da una griglia di linee a intervalli regolari di 10 micrometri chiamata gradi e sollevare l'obiettivo in modo che l'olio ne catturi il fuoco. Successivamente, mettere a fuoco il bordo esagonale del condensatore del campo. Fermarsi quando risulta allineato con l'illuminazione centrale di Kohler.

Il bordo esagonale deve essere centrato nell'oculare e messo a fuoco con precisione. Quindi, utilizzando le manopole di posizionamento dello stop di campo del condensatore, centrare lo stop di campo del condensatore rispetto al campo visivo. Avviare il software IP lab e inserire le impostazioni per far funzionare la telecamera.

Verificare che la fotocamera sia impostata sulla modalità di trasferimento frame. Eseguire il comando di acquisizione del fuoco per avviare l'anteprima in tempo reale. Impostare quindi il prefisso dell'indice e il percorso del file in cui verranno salvate le immagini.

Successivamente, avviare l'immagine RS. Impostare le configurazioni per il funzionamento della fotocamera cool snap. La modalità di clocking deve essere impostata su normale.

Avviare il software DMD. Posizionare l'iride per campo scuro nel menu script. Quindi fare clic su carica e reimposta.

Per eseguire manualmente lo script, impostare la barra ottica del microscopio nel viewport su LSM. Questo invierà l'immagine attraverso il DMD nell'ottica allineata. Proiettare l'immagine in campo scuro sul CCD della fotocamera Cascade five 12.

L'immagine in campo oscuro dovrebbe apparire nell'anteprima in tempo reale su IP lab. Se necessario, mettere a fuoco l'immagine nell'anteprima in tempo reale. Impostare il tempo di esposizione sufficientemente alto da garantire almeno 10.000 conteggi di segnale nell'immagine.

Quindi acquisire un'istantanea del campo visivo utilizzando il comando acquisizione singola dopo l'acquisizione. Utilizzare il comando salva come indicizzato per salvare l'immagine sul disco. L'immagine del GTI misura le dimensioni del campo visivo.

Ora spostare il campione GTI in modo che si trovi al di fuori del campo visivo e sia visibile solo lo sfondo. Acquisire un'immagine di sfondo del campo con un tempo di esposizione sufficiente per ottenere almeno 5.000 conteggi. Questa immagine sarà utile per la sottrazione dello sfondo dalle immagini non filtrate.

Ora, per acquisire immagini filtrate con filtro di Gabor dello sfondo, caricare lo script della banca di filtri di Gabor nel software di controllo del DMD. Eseguire l'intero script per caricare i filtri nella memoria integrata del DMD. Ciò potrebbe richiedere alcuni minuti una volta completato il caricamento dell'intero script.

Utilizzare i marcatori di inizio e fine all'interno del software DMD per assicurarsi che un solo set di filtri corrispondente a un singolo filtro di tipo Gabor venga caricato alla volta. Eseguire lo script per acquisire immagini filtrate dello sfondo. L'anteprima dell'immagine in tempo reale dovrebbe passare da campo scuro all'immagine filtrata.

Per quel filtro, aprire lo script di acquisizione in IP lab dal disco. Regolare il tempo di esposizione per garantire che vengano acquisiti almeno 2000 conteggi. Mentre lo script DMD è in esecuzione, annullare l'anteprima in tempo reale in IP lab ed eseguire lo script di acquisizione.

Questo acquisirà automaticamente l'indice e salverà l'immagine filtrata su disco. Una volta acquisita la prima immagine, arrestare lo script in esecuzione in DMD. Eliminare i comandi utilizzati dallo script.

Sostituire quindi i marcatori di inizio e fine all'inizio e alla fine del successivo set di filtri. Ripetere l'acquisizione nel laboratorio di IP fino a quando non è stato utilizzato l'intero banco di filtri e sono state acquisite e salvate tutte le immagini filtrate. Prepararsi a seminare le cellule collegando un saldatore al banco del laboratorio e riscaldando il mezzo L 15 a 37 gradi Celsius.

Preparare una postazione di lavoro con un tovagliolo di carta e una salvietta Kim per assorbire qualsiasi mezzo versato e mantenere l'area pulita. Preparare diversi stoppini strappando e arrotolando le salviette Kim. Gli stoppini verranno utilizzati per aspirare il liquido attraverso la piastra cellulare.

Successivamente, utilizzare il portacampioni in metallo per creare un sandwich cellulare. Usare una siringa per applicare un sottile filo di grasso da vuoto lungo la periferia superiore del foro nella piastra in metallo lavorata, estendendosi per circa metà della distanza fino alle estremità delle scanalature su ciascun lato. Far scivolare delicatamente un coprioggetto pulito numero uno sul grasso.

Rovesciare la piastra e applicare il grasso attorno al foro. Spegnere le luci della stanza indossando guanti per esame NI sterilizzati con etanolo. Prelevare le cellule dall'incubatore.

Rimuovere il vetrino coprioggetto che verrà utilizzato per l'esperimento dalla piastra a sei pozzetti. Asciugare con cura il vetrino coprioggetto. Quindi premere il vetrino coprioggetto con il lato delle cellule rivolto verso il basso sulla piastra metallica unta, sopra il foro di osservazione.

Inserire le cellule all'interno della piastra. Assicurarsi che non rimangano bolle d'aria e che il grasso abbia formato un sigillo impermeabile in modo da poter caricare il mezzo. Ora capovolgere nuovamente la piastra, aggiungendo 200 microlitri alla volta mediante pipetta.

Aggiungere il mezzo L 15 preriscaldato nel sandwich attraverso la scanalatura tra il coprivetrino superiore e la piastra metallica fino a quando il liquido non raggiunge quasi la scanalatura sul lato opposto. Successivamente, lavare le cellule posizionando una micropipetta all'estremità della scanalatura opposta ed aggiungendo con una pipetta ulteriori 200 microlitri di mezzo nel sandwich. Il mezzo fluirà da un lato all'altro mentre la micropipetta rimuove il mezzo vecchio.

Si tenga attenzione a evitare la formazione di bolle all'interno del liquido durante questo passaggio. Ripetere questa procedura da due a tre volte utilizzando una nuova micropipetta ad ogni risciacquo. Ora capovolgere nuovamente la piastra, sorreggendola dai bordi in modo da trattenere il liquido nel serbatoio della cella.

Immergere il saldatore nel becher di veap per sciogliere rapidamente una certa quantità di veap, che aderirà quindi alla punta del saldatore. Utilizzando con attenzione la punta del saldatore, applicare il veap fuso lungo i bordi del coprioggetto inferiore. Continuare a immergere e applicare lungo tutto il perimetro del coprioggetto, sigillandolo sulla piastra metallica.

Questo crea un buon sigillo meccanico in modo che il vetrino non si stacchi dalla piastra durante l'osservazione. Rimuovere eventuali residui dalla parte inferiore. Pulire la superficie del vetrino arrotolando un fazzoletto di carta kim e utilizzandolo per la pulizia del vetrino.

Fare scivolare in un unico movimento per garantire che il coprioggetto sia più pulito al centro, dove verrà osservato. Riposizionare la piastra a sei pozzetti nell'incubatrice. Portare le cellule piastrate al laboratorio di ottica e montarle sull'obiettivo.

Come in precedenza, individuare un campo di cellule dall'aspetto sano ed acquisire un'immagine in campo scuro del campo visivo. Successivamente, allineare il microscopio in contrasto di interferenza differenziale (DIC) e verificare che i tempi di esposizione siano adeguati. Acquisire un'immagine DIC mediante una camera a cascata.

In questa configurazione, le immagini fluorescenti vengono acquisite utilizzando la fotocamera cool SNAP mentre il microscopio è ancora allineato in DIC. Impostare il valore VAR del microscopio su 1x e il mirino al 100% binoculare, quindi deviare l'immagine dall'oculare alla fotocamera. Posizionare un LED blu sopra il condensatore per illuminare il campo.

Quindi visualizzare in anteprima il campo visivo nell'immagine RSS e regolare con precisione il fuoco. Se necessario, acquisire un'immagine DIC e salvarla su disco. Osservare come il campo visivo differisca da quello ottenuto con la fotocamera a cascata.

Queste immagini dovranno essere registrate durante la fase di analisi dell'esperimento. Successivamente, posizionare il cubo del filtro fluorescente e acquisire un'immagine in fluorescenza attivando brevemente l'eccitazione della fluorescenza mediante l'otturatore del microscopio, quindi disattivarla non appena l'acquisizione è completata. Per ridurre al minimo il fotoblesamento, salvare l'immagine in fluorescenza su disco.

Per acquisire immagini filtrate, reimpostare il microscopio sul campo e inviare la luce attraverso la porta LSM. Come in precedenza, eseguire l'intero script della banca di filtri di Gabor come prima per completare l'acquisizione dei dati per un singolo punto temporale, mentre le cellule sono ancora sulla piastra e senza disturbare il campo visivo. Utilizzare il metodo di drenaggio per sostituire il normale mezzo L 15 con lo stesso contenente una soluzione di STS ad una concentrazione di un micromolare.

Durante l'esperimento, aggiungere ulteriore mezzo per evitare l'essiccamento, pipettando il mezzo nella scanalatura della piastra cellulare senza rimuoverla dal palchetto né disturbare il campo visivo. A questo punto, ripetere questi passaggi per i successivi punti temporali fino al completamento dell'esperimento. I dati raccolti comprenderanno un elevato numero di immagini filtrate che dovranno essere elaborate per estrarre i dati strutturali subcellulari.

Qui sono mostrati due esempi di esperimenti. Questa figura mostra immagini sequenziali di un campione di alghe diatomee marine. Le caratteristiche orientate sono chiaramente visibili.

Nell'immagine in campo scuro. Le immagini otticamente filtrate, etichettate da cinque uguale a zero gradi a cinque uguale a 160 gradi, sono mostrate accanto all'immagine non filtrata del campione. A scopo comparativo, l'insieme delle nove immagini filtrate con il filtro di Gabor della diatomea è stato elaborato pixel per pixel per determinare l'orientamento dell'oggetto.

In ogni pixel, il segnale massimo è stato diviso per il segnale medio in funzione dell'orientamento del filtro, ottenendo un valore di rapporto dimensionale. Un rapporto dimensionale vicino a uno, indicato in blu, è presente nelle aree in cui non vi è un angolo di risposta preferito. Valori più elevati, indicati in rosso, indicano aree in cui è presente una risposta a un angolo preferito più alto.

L'intensità luminosa e il significato del codice della risposta totale del filtro GABOR, nonché l'orientamento del filtro, forniscono il segnale massimo in corrispondenza di ciascun pixel lungo la direzione perpendicolare all'orientamento dell'oggetto sottostante. L'orientamento delle sottostrutture particellari è codificato in un grafico a frecce (quiver plot), in cui ogni linea rispecchia fedelmente l'orientamento locale dell'oggetto sottostante visibile nel campo scuro non filtrato. Il grafico a frecce mostra l'orientamento degli oggetti con intensità di risposta superiori al 10% del valore massimo.

Queste immagini in campo scuro e con filtro ottico di un campo contenevano cellule endoteliali bovine vive; successivamente, le immagini filtrate sono state acquisite ogni 20 minuti per un periodo di tre ore dopo il trattamento con l'induttore dell'apoptosi stor sporin. Qui, la mappa del rapporto di aspetto nel pannello superiore e l'immagine di fluorescenza dei mitocondri nel pannello inferiore sono mostrate in funzione del tempo. La tonalità del colore rappresenta il grado di orientamento; come in precedenza, questi grafici temporali confrontano la riduzione del grado di orientamento del rapporto di aspetto delle particelle nelle cellule endoteliali trattate con s thoro sporin, mentre le tracce individuali rappresentano grafici temporali all'interno di singole cellule.

L'orientamento dei drop-in è limitato alle regioni delle cellule che corrispondono alle aree fluorescenti. A questo punto, la validazione rispetto alla fluorescenza è stata completata. Diventa archiviale.

Pertanto, nei prossimi esperimenti, le misurazioni mitocondriali possono essere effettuate omettendo i passaggi di imaging della fluorescenza e utilizzando direttamente il metodo dello scattering ottico. Vi abbiamo appena mostrato come monitorare la frammentazione mitocondriale durante l'apoptosi mediante firme di scattering della luce basate su filtri di Gabor. Quando si esegue questa procedura, è importante predisporre correttamente il campione e assicurarsi che l'allestimento ottico sia ben allineato e calibrato.

Quindi, prendiamo in considerazione l'utilizzo di Sense per l'osservazione e CoLab con esperimenti con interfaccia utente.