MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato
29 aprile 2007
Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l'analisi dei peptidi e proteine da Matrix-Assisted Laser ionizzazione di desorbimento spettrometria di massa (MALDI-MS).
Benvenuti al tutorial del laboratorio CHI sul metodo dello strato ultra sottile, particolarmente utile per la determinazione accurata della massa delle proteine. A causa della sensibilità della spettrometria di massa, utilizziamo esclusivamente reagenti di grado HPLC e guanti in lattice o nitrile senza polvere per pulire la piastra. Sciacquare alternando metanolo e acqua, e infine nuovamente metanolo.
Ad ogni risciacquo, rimuovere delicatamente il solvente in eccesso utilizzando carta per lenti. È possibile ripetere queste operazioni di lavaggio tante volte quante sono necessarie per ottenere una piastra pulita. Una volta pulita e asciutta, la piastra deve essere utilizzata immediatamente.
Applicare e distribuire da 20 a 30 microlitri di soluzione del substrato in strato sottile su una piastra MALDI pulita. Utilizziamo qui una punta per pipetta P2-50 per distribuire uniformemente la soluzione, evitando di graffiare la piastra. Mentre lo strato sottile si asciuga, rimuovere delicatamente con un fazzoletto di carta kim qualunque goccia d'acqua residua, se presente.
Quindi pulire delicatamente la piastra con un movimento uniforme utilizzando un fazzoletto di carta Kim per formare correttamente lo strato sottile. Infine, pulire i bordi della piastra per evitare di contaminare lo spettrometro di massa. È fondamentale verificare lo strato sottile prima di applicare il campione.
Se la macchia di prova impiega troppo tempo ad asciugare e i cristalli non sono omogenei, il problema potrebbe risiedere nel rivestimento sottile stesso o nella soluzione della matrice; pulire la piastra, riapplicare il rivestimento sottile e ripetere il test. Quando si applicano le macchie sul rivestimeno sottile, non si desidera che le macchie evaporino fino a seccarsi completamente. Al contrario, una volta che la cristallizzazione si è rallentata e arrestata, rimuovere il solvente in eccesso.
Utilizzando un aspiratore a vuoto, la presenza di contaminanti come sali e detergenti, così come un'elevata concentrazione dell'analita, può interferire con la cristallizzazione. Un'ulteriore diluizione del campione potrebbe migliorare la cristallizzazione. Individuare le macchie delle formiche in prossimità del campione. Questo permetterà una calibrazione pseudo-interna, nella quale la piastra viene spostata dalla macchia del campione alla macchia di calibrazione.
Durante l'acquisizione del campione, aggiungendo alcuni impulsi laser del CAS allo spettro, questo approccio garantisce una calibrazione con maggiore accuratezza di massa rispetto alla sola calibrazione esterna. È molto importante rimuovere qualsiasi contaminante, come sale o detergente, che potrebbe interferire con l'ionizzazione dell'analita. A tale scopo, depositare direttamente sulle macchie acqua ghiacciata, fredda, contenente acido trifluoroacetico allo 0,1% in grado HPLC.
Rimuovere la soluzione di lavaggio utilizzando un aspiratore a vuoto come mostrato qui. Questo metodo produce spettri eccellenti sia per le proteine di membrana che per quelle solubili.
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Panoramica
Questo video illustra la preparazione di uno strato ultra-sottile di matrice/analita per l'analisi di peptidi e proteine mediante spettrometria di massa con desorbimento laser assistito da matrice (MALDI-MS). Il metodo è essenziale per la determinazione accurata della massa delle proteine.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Spettrometria di Massa
- Analisi delle Proteine
- Chimica Analitica
Sfondo
- La spettrometria di massa è una tecnica sensibile per l'analisi di biomolecole.
- La preparazione della piastra del campione è fondamentale per ottenere risultati accurati.
- Si raccomandano reagenti di grado HPLC per la pulizia.
- Procedure adeguate di manipolazione e pulizia migliorano la qualità dell'analisi.
Scopo dello studio
- Dimostrare il metodo del sottile strato per la spettrometria di massa MALDI.
- Garantire una determinazione accurata della massa delle proteine.
- Fornire un tutorial sulle migliori pratiche per la preparazione del campione.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di reagenti di grado HPLC.
- Pulizia della piastra con metanolo e acqua.
- Asportazione del solvente in eccesso con carta per lenti.
- Uso immediato della piastra pulita per l'analisi.
Risultati principali
- Illustrato metodi efficaci per la pulizia della piastra del campione.
- Evidenziata l'importanza dell'uso di materiali appropriati.
- Mostrati i passaggi di preparazione per uno strato ultra-sottile.
- Fornite indicazioni per mantenere l'integrità del campione.
Conclusioni
- Il metodo dello strato ultra-sottile è fondamentale per una spettrometria di massa accurata.
- Le tecniche corrette di pulizia e preparazione sono essenziali.
- Seguire le migliori pratiche può migliorare significativamente i risultati dell'analisi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La determinazione accurata della massa delle proteine è fondamentale per la validazione degli obiettivi e l'identificazione dei composti guida nella fase iniziale della scoperta. Il metodo di preparazione del campione MALDI con strato ultra sottile migliora la qualità dei dati aumentando la tolleranza alle impurità e l'uniformità spaziale, consentendo una valutazione affidabile dei composti. Questo metodo permette una caratterizzazione proteica con maggiore affidabilità predittiva, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella selezione dei modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente la determinazione accurata della massa delle proteine, supportando l'analisi delle ipotesi terapeutiche e la validazione funzionale dei bersagli.
- Valore operativo: Offre una maggiore tolleranza verso sali e detergenti, riducendo i falsi negativi nei campioni soggetti a impurità.
- Valore predittivo: Migliora la risoluzione e l'uniformità spaziale, aumentando la sicurezza nell'identificazione delle proteine e nello stato di modificazione.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Produce spettri di alta qualità e riproducibili, essenziali per la standardizzazione dei saggi e la coerenza delle letture quantitative.
- Valore operativo: Utilizza passaggi semplici e robusti, compatibili con ambienti di screening ad alto rendimento.
- Scalabilità: Consente la preparazione di piastre campione validate per flussi di lavoro successivi, favorendo il riutilizzo della piattaforma in diversi progetti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Supporta l'analisi di proteine sia di membrana che solubili, consentendo la caratterizzazione di sistemi rilevanti per le malattie.
- De-risking meccanicistico: Permette una determinazione accurata della massa di proteine con ampie gamme di massa (fino a 380 kDa), facilitando l'ottimizzazione del composto candidato.
- Allineamento ai modelli preclinici: Applicabile a canali ionici, trasportatori e recettori, supporta la validazione del bersaglio in modelli fisiologicamente rilevanti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo dello strato ultra-sottile si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio all'identificazione del composto promettente fino al profilo preclinico, consentendo un'analisi proteica affidabile a ogni stadio.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi fornendo dati di massa accurati per l'identificazione e la caratterizzazione delle proteine.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili che consentono una valutazione affidabile dei composti nello sviluppo dei saggi.
- Analisi: Genera spettri di massa ad alta risoluzione con uniformità spaziale, migliorando la comparabilità dei dati tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla continuità preclinica attraverso analisi di massa proteica coerenti su diversi tipi di campioni.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità standardizzata e robusta di preparazione dei campioni applicabile a diverse classi di proteine e progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella determinazione della massa proteica, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella validazione del target.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e tolleranza a contaminanti comuni come sali e detergenti.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui grazie a una qualità superiore dei dati, con riduzione del rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio basata su dati affidabili di caratterizzazione proteica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei campioni per spettrometria di massa e nei principi della MALDI-MS.
- Necessita dell'accesso a reagenti di grado HPLC, aspiratore a vuoto e piastre compatibili con la MALDI.
- Richiede procedure standardizzate di pulizia e asciugatura per garantire l'uniformità del rivestimento.
- Richiede adattamenti in base alle diverse concentrazioni di analita e alle matrici campionarie.
- Limitato dalla necessità di utilizzare immediatamente le piastre dopo la pulizia per evitare recontaminazioni.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
2:05
Step 5: test of the thin layer
2:50
Step 6: sample application
3:47
Step 7: calibrant application
1:52
Step 4: preparation of the matrix solution
0:58
Step 3: making the thin layer substrate
0:20
Step 1: cleaning of the sample plate
4:20
Step 8: washing step
0:46
Step 2: preparation of the thin layer substrate solution
5:05
Step 9: acquisition of mass spectra
