Video Bioinformatica Analisi delle embrionali umane crescita Colony cellule staminali

Questo protocollo illustra un metodo di bioinformatica video per misurare la crescita delle colonie di cellule staminali embrionali umane analizzando video in time-lapse raccolti in un incubatore icon bio station CT, dotato di una telecamera per l'acquisizione video. Le colonie di cellule staminali embrionali umane, o colonie HESC, vengono coltivate fino al 70% di confluenza, ripiastrellate e incubate per 48 ore, dopo di che le colonie HESC vengono filmate per ulteriori 48 ore nel Biot ct. Il tasso di crescita viene determinato utilizzando ricette di segmentazione, potenziamento e misurazione sviluppate con il software CL quant.

Le ricette sono state convalidate mediante confronto con Adobe Photoshop, uno strumento di analisi delle immagini che consente un adattamento manuale preciso della maschera a ciascuna colonia. Il campo emergente della bioinformatica video può essere utilizzato per automatizzare l'elaborazione, l'analisi e l'estrazione di dati biologici da video microscopici. Ciao, sono Serena Lin del laboratorio del Dott. Prue Talbot del Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze dell'Università della California a Riverside.

Ciao, sono Sean Fino, anch'io del Talbot Lab. Ciao, sono TI Satish del programma di dottorato in Biologia Molecolare, Cellulare e dello Sviluppo. Oggi vi mostreremo come misurare la crescita delle colonie di cellule staminali embrionali umane utilizzando strumenti informatici per video.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per misurare gli effetti di agenti tossici ambientali sul comportamento delle cellule staminali embrionali umane. Dimostreremo questa procedura nella nostra nuova struttura centrale per le cellule staminali. Cominciamo dunque.

Per preparare le HESC per l'analisi video, coltivare le HESC su piastre a sei pozzetti rivestite con matrigel fino a raggiungere una confluenza del 70%. Aspirare il mezzo da un pozzetto contenente le HESC e risciacquare due volte con un millilitro di PBS. Aggiungere un millilitro di Accutase e incubare per un minuto a 37 gradi Celsius in atmosfera di 5% di anidride carbonica. Successivamente, aggiungere da 10 a 12 microperle di vetro nel pozzetto e agitare delicatamente la piastra finché le colonie non si saranno staccate completamente.

Neutralizzare l'Accutane utilizzando un millilitro di mezzo di mantenimento per cellule staminali embrionali umane o mezzo condizionato da fibroblasti embrionali di topo. Raccogliere le cellule staccate senza le microsfere in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 200 ×g per tre minuti. Decantare il sopranatante e risospendere il pellet con 500 microlitri di mezzo fresco di mantenimento per cellule staminali embrionali umane o M-T-E-S-R; piastrare 100 microlitri della sospensione di HESC goccia a goccia in più pozzetti di una piastra da 12 pozzetti rivestita con matrigel.

Muovere delicatamente la piastra avanti e indietro e osservare le colture al microscopio ottico per verificare che gli aggregati cellulari siano uniformemente distribuiti nei pozzetti. Collocare la piastra in un incubatore a 37 gradi e 5% di anidride carbonica per 48 ore, in modo che le cellule si attacchino bene e raggiungano dimensioni sufficientemente grandi da essere facilmente visibili. Dopo 48 ore, aspirare il mezzo e lavare i pozzetti con 500 microlitri di PBS per rimuovere le cellule non attaccate, quindi aggiungere 500 microlitri di mezzo M-T-E-S-R in ciascun pozzetto.

Posizionare immediatamente la piastra nel Biot CT e iniziare ad acquisire immagini in time-lapse. Provare a selezionare campi con colonie singole ben distinte, che non tendano a sovrapporsi ad altre colonie. In questo protocollo, le cellule vengono registrate in video per ulteriori 48 ore con acquisizioni a intervalli di sette minuti.

Per creare la ricetta di segmentazione, scansionare manualmente l'intero video per verificare che contenga una singola colonia che rimanga a fuoco per tutto il periodo di registrazione. Successivamente, aprire la procedura guidata di segmentazione nel software CL quants e fare clic sul pulsante successivo. Selezionare il canale immagine corretto e fare clic sul pulsante successivo.

Selezionare l'abbinamento morbido e fare clic su Avanti. Selezionare una o due aree desiderate cerchiando il bordo esterno fino all'area centrale della colonia. Questa area dovrebbe essere il più piccola possibile, ma deve essere rappresentativa dell'intera colonia.

Non selezionare troppe regioni, poiché ciò potrebbe causare un'applicazione inaccurata della maschera. Fare clic sul pulsante successivo. Selezionare le regioni da escludere circondando le aree che non fanno parte della colonia e non fanno parte dello sfondo.

Queste regioni presentano pattern che devono essere soppressi, come detriti e cellule morte. Fare clic su avanti. Selezionare lo sfondo circondando le regioni che non sono colonie, detriti o cellule morte.

Lo sfondo deve essere uniforme e probabilmente visibile in ogni fotogramma. In genere, selezioniamo lo sfondo grigio intorno alla colonia. Fare clic sul pulsante successivo.

Una maschera colorata dovrebbe essere visualizzata sulla regione di interesse se la maschera non copre in modo accurato la regione di interesse. L'intervallo della soglia di segmentazione nell'angolo in basso a destra dello schermo può essere aumentato o diminuito se è necessario modificare la maschera. Selezionare aggiorna le regioni con corrispondenza morbida.

Questo consente di modificare le aree desiderate, non desiderate o di sfondo. Se la maschera è soddisfacente, selezionare applica soglia e salva la mia maschera. Quindi fare clic sul pulsante successivo.

La maschera verrà quindi visualizzata in un colore diverso. Selezionare fine. La ricetta dovrebbe essere visualizzata nell'angolo superiore destro del software come ricetta di segmentazione.

Rinominare la ricetta, se desiderato, facendo clic con il tasto destro e inserendo un nuovo nome. Per applicare la ricetta, fare clic con il tasto destro e posizionare il cursore del mouse sopra.

Applica la ricetta. Verrà visualizzato un menu che consente la selezione del numero di fotogrammi da utilizzare. Imposta l'intervallo tra i fotogrammi a ogni 20 fotogrammi per garantire la fedeltà della maschera.

Controllare manualmente in modo casuale il 10% dei fotogrammi ai quali è stata applicata la maschera, per creare una ricetta di miglioramento che elimini le regioni indesiderate presenti nei detriti. Fare clic con il tasto destro sulla cartella della ricetta di miglioramento, quindi fare clic su nuova. Una nuova ricetta di miglioramento dovrebbe essere visualizzata a partire dal campo originale di osservazione.

Spostare il cursore del mouse sugli icone nella barra degli strumenti per identificare il pulsante del modulo di attivazione/disattivazione posizionato a destra dell'immagine e fare clic su di esso. Selezionare il menu a discesa per l'etichettatura. Selezionare l'etichettatura per la connessione due collegata.

Dovrebbe essere visualizzata una nuova barra delle attività. Prendere la maschera iniziale dalla ricetta di segmentazione e trascinarla nella casella di input. La barra ora dovrebbe mostrare il numero della maschera di input.

Trascinare l'icona con il numero della maschera di input sull'icona della maschera zero. Individuare la dimensione minima nella barra delle attività e regolare il numero finché viene visualizzata solo la regione di interesse. Assicurarsi di fare clic su esegui per ogni prova di adattamento.

Dopo aver ottenuto un aggiustamento soddisfacente della dimensione minima, fare clic sulla ricetta di miglioramento precedente nella parte inferiore dello schermo e selezionare "salva nella ricetta". Il software ora chiede di sovrascrivere la ricetta selezionata: scegliere "sì" per l'area. Verificare la ricetta di miglioramento utilizzando la stessa procedura impiegata per il controllo puntuale della segmentazione.

Se si è soddisfatti delle ricette di segmentazione e miglioramento, procedere alla creazione del modello di misurazione. Per iniziare, selezionare Crea modello di misurazione sulla barra degli strumenti a destra. Nella finestra di misurazione, spostare il cursore sulla figura della cellula in clip art.

Tenere premuto il tasto di controllo e selezionare la cella nella sezione di morfologia, deselezionare il parametro predefinito e selezionare il parametro di area. Quindi uscire dalla finestra del modello. Selezionare l'icona.

Crea una ricetta di misurazione. Rinomina la ricetta. Vai alla scheda modello e selezionala. Nell'angolo in alto a destra, trascina e rilascia il modello di misurazione precedentemente creato sulla finestra di misurazione.

Fare clic su sì per continuare nella finestra della ricetta di misurazione, selezionare i mapping dei canali. Quindi selezionare i mapping della maschera per cellula intera. Successivamente, selezionare l'opzione cellula intera. Per una maschera avanzata, selezionare la ricetta di misurazione nella scheda ricetta.

Nella finestra principale, selezionare l'icona di salvataggio all'interno della finestra della ricetta di misurazione. Chiudere quindi la finestra. Successivamente, chiudere e riaprire il campo visivo. Fare clic con il tasto destro sulla cartella dell'elenco delle ricette, quindi fare clic su nuova e trascinare le ricette nell'ordine richiesto dall'applicazione nell'elenco delle ricette, selezionare il blocco dell'elenco delle ricette ed eseguire le ricette in sequenza sui dati video utilizzando Adobe Photoshop.

Ogni 20° fotogramma delle stesse colonie è stato analizzato. Aprire manualmente un fotogramma dell'immagine di una colonia in Adobe Photoshop. Fare clic sullo strumento bacchetta magica nella barra degli strumenti.

Fare clic sull'area intorno alla colonia in modo da coprire l'intero campo, tranne la regione della colonia. Assicurarsi che la linea tratteggiata intorno alla colonia segua esattamente la periferia della colonia e non sia posizionata all'interno. Se la linea tratteggiata non segue la periferia, modificare il valore della tolleranza nella barra degli strumenti superiore di conseguenza.

Fare clic su modifica nella modalità maschera rapida nella barra degli strumenti e fare clic sulla colonia in modo che venga selezionata. Andare alla finestra, aprire il menu a discesa e fare clic su istogramma. La cache deve essere impostata su uno.

Se la cache è due, fare clic sul punto esclamativo dell'espressione per modificare la cache a uno. Registrare il valore del pixel in un foglio di calcolo. Ripetere il processo precedente per ogni fotogramma ventesimo.

I dati raccolti utilizzando Photoshop e il software CL quant possono quindi essere rappresentati insieme. Il nostro protocollo per la quantificazione della crescita delle colonie di HESC dimostra un'applicazione della video bioinformatica a un problema biologico. Qui mostriamo un grafico che confronta l'aumento delle dimensioni delle colonie nel periodo di 48 ore, determinato utilizzando il software CL quant e Adobe Photoshop.

Il grafico mostra cinque colonie diverse, ciascuna analizzata da entrambi i pacchetti software. Ogni colonia è rappresentata da un colore diverso. Le linee continue sono state ottenute utilizzando il software sail quant, mentre le linee tratteggiate sono state raccolte utilizzando Photoshop.

Il grafico dei dati grezzi mostra che entrambi i metodi di misurazione sono in buon accordo, tenendo conto del fatto che le colonie hanno dimensioni iniziali diverse. Questa figura mostra i dati riprodotti come aumento percentuale della dimensione della colonia. I tassi di crescita sono simili indipendentemente dalle dimensioni iniziali della colonia e entrambe le misure di analisi forniscono risultati simili.

Il seguente grafico mostra le medie dei dati percentuali di variazione precedenti sulla crescita delle colonie di HESC. Questo grafico evidenzia chiaramente un buon accordo tra l'analisi effettuata utilizzando strumenti di bioinformatica video e Adobe Photoshop. Vi abbiamo appena mostrato come misurare la crescita delle colonie di cellule staminali embrionali umane mediante l'uso di strumenti di bioinformatica video.

Quando si esegue questa procedura utilizzando la microscopia a contrasto di fase, assicurarsi di includere l'alone attorno alla colonia per una selezione precisa della colonia da parte del software. È inoltre importante ricordare che altri metodi per la coltivazione, l'incubazione e l'acquisizione video possono essere utilizzati al posto del protocollo da noi dimostrato. Una volta sviluppate e validate le ricette, queste eseguiranno l'analisi molto più rapidamente e con minore variabilità sperimentale rispetto all'analisi manuale.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.