Cronico Salmonella Modello mouse infetti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire un modello murino infetto cronico da salmonella. Questo viene raggiunto innanzitutto preparando una soluzione di salmonella. Il secondo passaggio della procedura consiste nel somministrare per sondino ai topi streptomicina, seguita da salmonella, oppure soltanto streptomicina.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'isolare il salmonella dalle feci di topo e nel rilevare l'infezione da salmonella nell'intestino del topo utilizzando piastre cromogeniche BL. L'ultimo passaggio della procedura è osservare e registrare la massa corporea del topo e annotare i cambiamenti nella vitalità successivi all'infezione da salmonella. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano come un'infezione da salmonella possa essere stabilita nell'intestino di topi trattati con salmonella mediante gavaggio.

Ciao, sono Michelle P del laboratorio del Dottor Johnson del Dipartimento di Medicina dell'Università di Rochester. Sono anche del Laboratorio Sun e sono Y del Laboratorio Sun. Oggi vi mostreremo un procedimento per stabilire un modello di massa infetta da Alytic Lennar.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la trasduzione del segnale nell'interazione tra batteri ospite e la genesi tumorale. Cominciamo. Prima dell'esperimento, preparare un numero sufficiente di piastre con brodo luria, berti o LB per ciascun ceppo di salmonella e da utilizzare durante tutto l'esperimento.

Le piastre possono essere refrigerate e conservate per diversi mesi. Successivamente, preparare la coltura di salmonella. Rimuovere una provetta di salmonella congelata a meno 80 gradi Celsius e lasciarla scongelare sul banco per la semina della salmonella su fiamma.

Passare una pipetta in un becco Bunsen e immergerla nella coltura batterica scongelata. Tracciare un percorso a zigzag avanti e indietro nella parte superiore del terzo della piastra LB. Passare nuovamente la pipetta alla fiamma e ruotare la piastra.

Tracciare un percorso a zigzag con l’ansa per attraversare le strisciate precedenti e distribuire i batteri sui due terzi successivi della piastra. Ripetere ancora una volta. Rigenerare l’ansa alla fiamma.

Non permettere al filo di penetrare nell'agar. Lasciare crescere le colonie riponendo le piastre in un incubatore a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Se eseguito correttamente, la piastra di salmonella dovrebbe produrre colonie singole in almeno una sezione.

Il giorno successivo. Selezionare una colonia dalla piastra LB utilizzando un bastoncino sterile o un'ansa batteriologica e trasferirla in sette millilitri di LB contenuti in un tubo da 12 millilitri. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius sotto agitazione per circa cinque ore.

Utilizzare 0,05 millilitri di questa coltura per inoculare 50 millilitri di LB in un tubo Falcon. Incubare a 37 gradi Celsius senza agitazione per circa 18 ore.

Centrifugare la coltura batterica da 50 millilitri, coltivata tutta la notte, a temperatura ambiente a 5.000 giri al minuto per 10 minuti e scartare il soprannatante. Successivamente, aggiungere 1,5 millilitri di soluzione salina tampone di Hank o HBSS al tubo per risospendere i batteri, in un rapporto di 100 parti di LB a tre parti di HBSS. Portare quindi il volume totale a 15 millilitri con HBSS o in un rapporto uno a dieci di LB rispetto a HBSS.

Ogni topo richiede 100 microlitri di cultura diluita di salmonella, ovvero da uno per 10 alla sesta a uno per 10 alla ottava unità formanti colonie, prima di iniziare il prelievo per sondino gastrico, privando i topi di acqua e cibo quattro ore prima dell'esperimento. Preparare quindi una soluzione di streptomicina immediatamente prima del sondino gastrico diluendo 7,5 milligrammi di streptomicina in polvere in 100 microlitri di HBSS. Per ogni topo da iniettare, assicurarsi di preparare un volume aggiuntivo per compensare le perdite prima del sondino gastrico.

Preparare innanzitutto un ago da somministrazione con 100 microlitri di soluzione di streptomicina. Rimuovere il primo topo dalla gabbia per effettuare la gavaggio e tenere il topo rivolto verso il piano del bancone. Afferrare saldamente la pelle sopra la spalla del topo con il pollice e il dito medio, distendendo la testa e il collo con l'indice per rendere l'esofago dritto.

Indirizzare la punta a sfera dell'ago di alimentazione lungo il palato e verso il lato destro della parte posteriore della faringe. Quindi farlo scendere delicatamente nell'esofago e iniettare i 100 microlitri di soluzione di streptomicina. Non si dovrebbe avvertire alcuna resistenza.

Ripetere questo processo per tutti i topi sperimentali e di controllo sottoposti a sperimentazione. Circa 20 ore dopo lo strp de m e la somministrazione per gavaggio, e quattro ore prima della somministrazione per gavaggio di salmonella, rimuovere acqua e cibo dai topi che riceveranno salmonella per gavaggio per via orale. Somministrare per gavaggio a ciascun topo nello stesso modo di prima, utilizzando 100 microlitri di soluzione di salmonella in HBSS.

Dopo la gavaggio, trasferire ogni topo in una nuova gabbia per iniziare la raccolta delle feci. A partire da circa otto ore dopo il gavaggio, rimuovere immediatamente le feci dalla gabbia non appena espulse. Raccogliere 100 milligrammi di materiale fecale di topo come campione sperimentale.

Raccogliere i campioni quotidianamente o settimanalmente, a seconda della durata dello studio, per l'analisi di Salmonella nelle feci. Trasferire il campione fecale in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitro contenente un millilitro di PBS ed eseguire un'energica vortexazione, quindi centrifugare per 10 minuti a 800 RPM. Trasferire il soprannatante in una provetta pulita da 1,5 millilitro e centrifugare a 6.000 RPM per cinque minuti.

Eliminare il soprannatante e aggiungere 200 microlitri di PBS ai pellet, quindi vortexare per risospendere. Successivamente, rilevare il *Salmonella* mediante una piastra BB l roag. Utilizzare da 10 a 100 microlitri di soluzione di materiale fecale per piastra, spargendola sulla piastra come mostrato nella sezione due.

Le specie di salmonella appaiono di colore mar a causa delle differenze metaboliche in presenza di cromogeni selezionati. Contare le colonie di salmonella sulla piastra per confrontare il livello di infezione tra topi singoli. In questa procedura sperimentale abbiamo utilizzato topi femmine C 57 black six liberi da patogeni specifici, di età compresa tra sei e sette settimane.

I topi sono stati infettati con salmonella e streptomicina più HBSS. I topi sono stati sottoposti a gavaggio controllato con streptomicina soltanto. I ceppi di salmonella utilizzati includono il ceppo selvatico di salmonella typhimurium, ATCC 1 4 0 2 8 S FP C, un ceppo mutante non patogeno di salmonella e tre ceppi FPC del laboratorio del dottor James Madera che portano il gene virulenza-associato AAV R age in PSKW 29, un plasmide a bassa copia. Utilizzando questo protocollo, la colonizzazione da salmonella tyrian può essere rilevata nell'intestino del topo.

L'infezione cronica da salmonella è stata misurata analizzando le feci; sono stati raccolti campioni di peso corporeo e di tessuto intestinale per la colorazione immunofluorescente. Tipicamente, la perdita di peso corporeo e la morte si verificano entro quattro settimane dal contagio. Qui sono mostrate le proporzioni di sopravvivenza a quattro settimane dal contagio.

Una volta che i topi sopravvivono per quattro settimane dopo l'infezione, aumentano di peso corporeo e la frequenza di decessi diminuisce nelle successive 23 settimane. Nel complesso, oltre il 65% dei topi infettati con ceppi di salmonella, FSY fsy, A VRA nullo o fsy. A VRA eterozigote sopravvive oltre sei mesi con infezione persistente da salmonella nell'intestino.

Dopo l'infezione acuta, i sopravvissuti continuavano a essere portatori di salmonella, che poteva essere rilevata sei mesi dopo l'infezione mediante il metodo descritto in questo protocollo. L'analisi di immunofluorescenza di campioni di tessuto provenienti dall'intestino di topo mostra l'invasione della salmonella nella mucosa intestinale a 27 settimane dall'infezione. In questa immagine, i nuclei sono colorati in blu e le cellule infettate da salmonella sono mostrate in verde.

Come mostrato nel gruppo di controllo, non è presente una colorazione verde brillante, il che indica l'assenza di colonizzazione da salmonella. Al contrario, nei topi infettati da salmonella a 27 settimane dall'infezione, si osserva una colorazione verde brillante nella mucosa intestinale. Questo dimostra la persistenza dell'infezione da salmonella nel topo pretrattato con streptomicina.

Abbiamo appena mostrato come indurre un'infezione cronica in alcuni modelli murini. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di preparare frescamente una coltura per il garage, delle corrette competenze nel garage e di rilevare la presenza di ANA per assicurarsi che il modello sperimentale funzioni. È tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.