Eucarioti Analisi Profilo Polyribosome
15 giugno 2010
Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione di tradurre ribosomi delle cellule eucariotiche. Una volta estratto, i ribosomi sono separati in monosomes e poliribosomi per frazionamento gradiente di saccarosio per consentire diverse popolazioni ribosomiale da analizzare. Come tale, questo metodo è il gold standard per l'esame della regolamentazione della traduzione.
L'obiettivo generale di questa procedura è separare e confrontare le frazioni di monozona e poliribosomi dai lisati cellulari. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando le cellule di interesse. Il secondo passaggio della procedura consiste nel preparare il lisato cellulare.
Il terzo passaggio della procedura consiste nel centrifugare il lisato attraverso un gradiente di saccarosio. L'ultimo passaggio della procedura prevede la frazionatura del gradiente e la visualizzazione delle diverse popolazioni ribosomiali mediante tracciato UV. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano variazioni nella traduzione in diverse condizioni sperimentali attraverso l'analisi del profilo di poliribosomi.
Ciao, sono Anthony Esposito del laboratorio del Dott. Terry Goss Kinsey del dipartimento di genetica molecolare, microbiologia e immunologia presso l'UMD e la J Robert Wood Johnson Medical School. E io sono Marcus Lewis. Anch'io del laboratorio McKinsey qui alla R-W-J-M-S.
Oggi vi mostreremo una procedura per l'analisi dei poliribosomi. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le alterazioni nella sintesi proteica che derivano da mutazioni o fattori ambientali. Cominciamo. Saccarosio.
I gradienti devono essere preparati un giorno prima dell'uso per permettere loro di diventare continui. Mescolare i volumi appropriati delle soluzioni stock di saccarosio al 7% e al 47% per ottenere 48 millilitri di ciascuna delle seguenti concentrazioni di saccarosio: 7%, 17%, 27%, 37% e 47%. Aggiungere DTT 1 M a ciascuna soluzione di saccarosio fino a una concentrazione finale di 1 millimolare. Per versare i gradienti, fissare una pipetta per pasta a una siringa da 20 millilitri assicurandola e sigillandola con pellicola parafilm.
Aggiungere sette millilitri di saccarosio al 7% nella parte inferiore di un tubo da ultracentrifuga in poliammide da un pollice per 3,5 pollici. Successivamente, aggiungere sette millilitri di soluzione di saccarosio al 17% sotto la soluzione al 7% posizionando la punta della pipetta Pasteur vicino al fondo del tubo ed eseguendo la pipettatura lentamente. Occorrono almeno 20 secondi per versare ogni strato.
Ripetere con sette millilitri ciascuno di soluzioni di saccarosio al 27%, 37% e 47% quando il gradiente è stato preparato. Si dovrebbero osservare linee ben definite tra i diversi strati, indicando che si è verificato un mescolamento minimo. Conservare tutti i gradienti a quattro gradi Celsius durante la notte, insieme ai rotori, ai flaconi e alle provette che verranno utilizzati per raccogliere i campioni.
Per preparare estratti da cellule di lievito, iniziare coltivando cento di 25 millilitri di coltura di lievito fino a un OD 600 compreso tra 0,8 e 1. Aggiungere cicloeide alla coltura a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro e continuare ad agitare a 30 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo 15 minuti, versare la coltura in un flacone da centrifuga da 250 millilitri e riempire con ghiaccio.
Mantenere tutto in ghiaccio da questo punto in avanti; centrifugare a 8.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Resus, sospendere il pellet in 10 millilitri di tampone di lisi freddo su ghiaccio e trasferire in provette polipropileniche da 15 millilitri. Centrifugare a 5.900 ×g per tre minuti a quattro gradi Celsius Resus.
Sospendere il pellet in 0,5 millilitri di buffer di lisi. Trasferire la sospensione in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere quindi 0,5 millilitri di perle di vetro lavate con acido e preriscaldate. Vortexare le cellule per quattro intervalli di 30 secondi, raffreddando la provetta su ghiaccio per 30 secondi tra un intervallo e l'altro.
Quindi aggiungere altri 0,5 millilitri di buffer di lisi nel tubo da 1,5 millilitri e centrifugare a 5.000 × g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il soprannatante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare alla velocità massima per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Infine, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. L'estratto può essere conservato a meno 80 gradi Celsius prima di trasferire il lisato sul gradiente di saccarosio. Appoggiare la punta della pipetta alla parete del tubo in prossimità della superficie del gradiente e stratificare delicatamente il lisato sulla sommità del gradiente.
Per un gradiente di 35 millilitri, vengono caricati tipicamente 500 microlitri di lisato. Utilizzando pinzette, abbassare con attenzione il gradiente nel secchiello di un rotore a pendolo. Centrifugare i gradienti a 100.000 ×g per quattro ore a quattro gradi Celsius.
Circa 30 minuti prima del completamento della centrifugazione di quattro ore, collegare l'ago al perforatore del tubo e collegare la penna al monitor online di assorbanza e fluorescenza. Accendere l'alimentazione del monitor di assorbanza per consentire il raggiungimento di una linea di base stabile prima di analizzare i campioni.
L'acquisizione elettronica del profilo PolyZone può essere facilmente ottenuta in tempo reale collegando un'unità di acquisizione dati DI 1 48 U. Al registratore cartografico, riempire la pompa a siringa con 50 millilitri di florin nuts utilizzando l'impostazione rapida a flusso inverso. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria.
Collegare il tubo della siringa al perforatore del tubo. Accendere brevemente il flusso di Flo inert in direzione diretta a sei millilitri al minuto. Per eliminare eventuali bolle d'aria dal tubo, posizionare una serie di tubi sotto l'estremità del tubo al termine della cella di flusso per raccogliere il campione in eccesso.
Preparare un secchio con ghiaccio con un'incavatura preformata per contenere il tubo da centrifuga contenente il gradiente di saccarosio. Al termine della centrifugazione di quattro ore, rimuovere con attenzione i tubi da centrifuga dal rotore della centrifuga e posizionarli sul ghiaccio, avendo cura di non disturbare i gradienti.
Per analizzare gli estratti cellulari, posizionare il tubo del gradiente sul perforatore e collegare la parte superiore del tubo all'uscita, quindi fissarlo. Alzare la piattaforma inferiore fino al tubo della centrifuga in modo che l'ago perfori il fondo del tubo. Avviare il flusso di Florin alert in direzione diretta a sei millilitri al minuto.
Una volta che il flusso è iniziato a entrare nel tubo, monitorare il movimento dell'ago sul rilevatore online di assorbanza UV. Quando l'ago inizia a muoversi, attivare il movimento del tracciato impostandolo su una velocità di 60. Quando viene raggiunta la fine del profilo dei poliribosomi, spegnere il flusso di Flo inert verso il tubo della centrifuga e arrestare il movimento del tracciato sul monitor di assorbanza e fluorescenza.
Riassorbire il Flo inerte dalla provetta del centrifugato nella siringa avviando il flusso in direzione inversa a velocità elevata, facendo attenzione a non aspirare saccarosio dalla provetta nella siringa. Svitare la provetta dal perforatore, abbassare l'ago ed estrarre la provetta. Qui viene mostrato un tracciato rappresentativo di un estratto di ribosomi preparato da lievito in presenza di cyclo eide.
Vengono indicati i picchi di assorbanza UV contenenti poliribosomi e ribosomi A TS 60 s e 40 s. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire l'analisi dei poliribosomi. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di lavorare rapidamente, mantenendo i campioni freddi e privi di RNA.
Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna nei vostri esperimenti.
Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione di ribosomi in fase di traduzione da cellule eucariotiche, consentendo l'analisi di diverse popolazioni ribosomiali. Il metodo prevede la separazione dei ribosomi in monosomi e poliribosomi mediante frazionamento su gradiente di saccarosio, essenziale per lo studio della regolazione della traduzione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Genetica
Sfondo
- Comprendere la funzione del ribosoma è fondamentale per lo studio della sintesi proteica.
- Il profilo dei poliribosomi fornisce informazioni sulla regolazione della traduzione.
- Le tecniche di estrazione dei ribosomi sono alla base della ricerca in biologia molecolare.
- Fattori ambientali e mutazioni possono alterare la sintesi proteica.
Scopo dello studio
- Separare e confrontare le frazioni di monoribosomi e politribosomi da lisati cellulari.
- Visualizzare diverse popolazioni ribosomiali mediante tracciamento con raggi UV.
- Analizzare le variazioni nella traduzione in diverse condizioni sperimentali.
Metodi Utilizzati
- Coltivazione di cellule eucariotiche e preparazione di lisati cellulari.
- Centrifugazione attraverso un gradiente di saccarosio.
- Frazionamento del gradiente per isolare popolazioni di ribosomi.
- Visualizzazione dei profili ribosomiali mediante monitoraggio dell'assorbanza UV.
Risultati principali
- Separazione riuscita di monosomi e politribosomi.
- Visualizzazione chiara delle popolazioni ribosomiali mediante tracciamento UV.
- Analisi della regolazione della traduzione in diverse condizioni.
- Informazioni sull'impatto delle mutazioni sulla sintesi proteica.
Conclusioni
- Il protocollo è uno standard di riferimento per lo studio della regolazione della traduzione.
- Permette ai ricercatori di analizzare efficacemente la dinamica dei ribosomi.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei meccanismi molecolari della traduzione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
L'analisi del profilo dei poliribosomi consente ai team del settore biofarmaceutico di indagare i meccanismi di controllo della traduzione e di rilevare difetti nella sintesi proteica in punti critici della scoperta. Questo metodo fornisce informazioni quantitative sulla traduzione globale e specifica per trascritto, supportando una valutazione predittiva nella validazione degli obiettivi e nella riduzione dei rischi meccanicistici. La sua adattabilità a diversi sistemi eucariotici garantisce una rilevanza ampia per il portafoglio nella ricerca preclinica e traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente una valutazione diretta della regolazione traduzionale in condizioni di perturbazioni genetiche o ambientali.
- Permette una riduzione del rischio meccanicistica distinguendo i difetti nell'inizio rispetto all'allungamento/terminazione.
- Facilita la validazione funzionale del bersaglio quantificando i cambiamenti nei rapporti tra politiribosomi e monosomi.
- Fornisce una piattaforma per valutare l'impatto di interventi sperimentali sulla sintesi proteica.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce letture quantitative validate dell'impegno ribosomiale per la standardizzazione dei saggi.
- Permette la frazionamento riproducibile e il rilevamento basato sull'UV delle popolazioni ribosomiali.
- Prepara estratti biologici adatti per analisi a valle di mRNA o percorsi di analisi delle proteine.
- Supporta lo screening di composti che modulano il macchinario della traduzione o le vie regolatorie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la scoperta di biomarcatori traduzionali a intuizioni meccanicistiche sulla regolazione della sintesi proteica.
- Garantisce continuità dai modelli cellulari ai sistemi preclinici adattando protocolli attraverso specie eucariotiche.
- Informa decisioni di avanzamento proporzionate al rischio rivelando difetti traduzionali associati a modelli di malattia.
- Fornisce un contesto meccanicistico ai fenotipi osservati negli studi preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il profiling dei poliribosomi si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica permettendo un'analisi guidata da ipotesi della traduzione, sostenendo sia la validazione del bersaglio che l'identificazione dei composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Quantifica l'output traduttivo e chiarisce i meccanismi regolatori specifici per pathway.
- Screening: Offre una frazionatura robusta e quantitativa e output di assorbanza UV pronti per saggi.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative in tempo reale delle popolazioni ribosomiali per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega modelli cellulari e preclinici consentendo l'adattamento dei protocolli e l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per diversi studi traslazionali e meccanicistici in vari programmi di R&S.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sul controllo traduttivo.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro di estrazione, frazionamento e rilevamento per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione rivelando colli di bottiglia traduttivi e supportando una selezione efficiente del portafoglio in termini di investimenti.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli e dei modelli in base alla fedeltà traduttiva, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in biologia del ribosoma e tecniche di frazionamento su gradiente.
- Richiede l'accesso a strumentazione per ultracentrifugazione e misurazione dell'assorbanza UV.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i gruppi di lavoro per ottenere risultati riproducibili.
- Adattabile a sistemi di lievito e mammiferi con modifiche al protocollo secondo necessità.
- L'integrità del campione e condizioni prive di RNasi sono fondamentali per risultati affidabili.
