Differenziazione delle cellule staminali embrionali in precursori degli oligodendrociti
19 maggio 2010
Descriviamo una piccola molecola a base di protocollo per la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). Questo protocollo genera Olig2 + NG2 + OPC ad alta efficienza da 30 giorni di differenziazione. Abbiamo anche descrivere un metodo per generare "chiodare" OPC che può sparare potenziali d'azione.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è generare precursori degli oligodendrociti a partire da cellule staminali embrionali mediante una serie di passaggi di coltura della durata di 30 giorni. Questo risultato si ottiene innanzitutto generando corpi embrionali a partire da cellule staminali embrionali di topo per avviare la differenziazione cellulare. Come secondo passaggio, i corpi embrionali vengono trattati con le molecole di piccole dimensioni acido retinoico e morfina pura, che inducono la differenziazione diretta delle cellule in un liga den.
Precursori cellulari. Come terzo passaggio, i corpi embrionali vengono dissociati in singole cellule dopo ulteriori 22 giorni. In coltura, circa l'80% delle cellule sono OPC.
Successivamente, gli OPC derivati da MESC vengono trasdotti con virus bao portatori della subunità NAV 1.2 al fine di generare OPC che producono potenziali d'azione; i risultati ottenuti mostrano l'espressione del marcatore degli OPC e le proprietà di generazione di potenziali d'azione di questi OPC derivati da MESC, basandosi su microscopia a immunofluorescenza e registrazioni elettrofisiologiche. Ciao, sono Pong Chiang del laboratorio del Dott. Ing del Dipartimento di Biologia Cellulare e Anatomia Umana dell'Università della California di Davis. Siamo inoltre affiliati all'Ospedale Shriners per Bambini della California Settentrionale.
Ciao, sono Vial Raj, anch'io del laboratorio Deng. Oggi vi mostreremo un procedimento per la differenziazione di cellule staminali embrionali murine in cellule precursori di oligodendrociti. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le proprietà dei precursori oligodendrocitari derivati da cellule staminali embrionali, al fine di generare cellule con un potenziale terapeutico migliore.
Iniziamo. Oggi, le cellule precursori degli oligodendrociti, o OPC, verranno generate dalla linea di cellule staminali embrionali del topo OG due GFP. Queste cellule staminali embrionali devono essere passaggiate ogni tre giorni per mantenerle sane a una densità ottimale e prevenire la differenziazione spontanea. Passaggio.
Le cellule ESS, quando raggiungono una confluenza del 70%, vanno trattate in un'area a flusso laminare. Rimuovere il mezzo di coltura sovrastante. Lavare con PBS e aggiungere la tripsina, utilizzando due millilitri di soluzione preriscaldata.
Un ciclo di LE express a triplo per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Arrestare la reazione e risospendere le cellule in quattro millilitri di mezzo cellulare MES. Trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 1000 RP per cinque minuti.
Risospendere nel mezzo MESL, un decimo delle cellule su uno strato confluenziale di feeder irradiati di meth in mezzo per cellule MES. Dopo tre giorni, le cellule ES sono circa al 70% confluenti e sono pronte per essere passaggiate o risospese per formare corpi embrionali e indurre la differenziazione. Trasformare le colonie di cellule ES di topo con tripsina come in precedenza, quindi risospendere le cellule in siero sostitutivo knockout o mezzo KSR. Contare le cellule con un emocitometro, diluire la sospensione in KSR.
Medio a 15.000 cellule per millilitro, piastrare tre millilitri in ogni pozzetto di una piastra di coltura ultralow adesiva a sei pozzetti. Incubare le cellule in sospensione a 37 gradi Celsius per quattro giorni. Cambiare completamente il mezzo ogni due giorni.
A partire dal quarto giorno, sostituire il mezzo giornalmente; il quarto giorno aggiungere al KSR 0,2 micromolari di acido retinoico; il quinto giorno integrare con acido retinoico e un micromolare di primor famine; dal sesto al settimo giorno, integrare con entrambi gli agenti. Nutrire gli embrioni in due mezzi, supplementati con 0,2 micromolari di acido retinoico e un micromolare di primor famine. Dopo otto giorni di coltura, la maggior parte degli embrioni esprime GFP ed è pronta per essere dissociata mediante trypsin eyes e i cellule vanno contate come in precedenza.
Quindi risospendere a 3,5 × 10⁵ cellule per millilitro. In mezzo OPC, rifornire tre millilitri della sospensione in mezzo OPC. Utilizzando piatti da 60 millimetri rivestiti con poliornitina, circa ogni settimana le cellule diventeranno confluenti e avranno questo aspetto; passaggi cellulari come in precedenza con una tripsinizzazione di tre minuti.
30 giorni dopo la sospensione originale di risospensione. Nel mezzo KSR, le cellule mostrano caratteristiche di cellule precursori oligodendrocitiche per generare OPC che producono potenziali d'azione. Utilizzare OPC derivati da ESL di topo che presentano una confluenza compresa tra il 50 e il 70%.
Sostituire il mezzo con un XPBS per risciacquare le cellule. Per introdurre il canale del sodio attivato da voltaggio. Subunità alfa 1.2.
Utilizziamo il kit del canale sodico back MAM. Mescolare un millilitro del componente A del back MAM con quattro millilitri di uno XPBS. Rimuovere il risciacquo con PBS e aggiungere il componente diluito.
A incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Sostituire l'agente di recupero con il mezzo OPC arricchito con i componenti B e C, come descritto nel kit. Incubare ulteriormente per due ore a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, sostituire il mezzo arricchito con mezzo OPC fresco. Dopo ulteriori 24 ore di coltura, gli OPC derivati da ESL possono essere sottoposti a saggio per la valutazione dell'attività elettrica impulsiva in questo punto temporale. I corpi embrioidi non mostrano alcuna fluorescenza GFP.
Gli EBS mostrano una forte espressione di GFP e sono pronti per la coltura dopo disaggregazione per circa 30 giorni dal sospensione originale di resus. Nel mezzo KSR, la maggior parte delle cellule è immuno positiva alla colorazione per NG due, il che è coerente con l'espressione di GFP. Tuttavia, a differenza degli OPC cerebrali, questi OPC derivati da cellule MES non generano potenziali d'azione anche quando le cellule vengono depolarizzate a zero millivolt.
Dopo l'introduzione della subunità NAV 1.2 mediante trasduzione virale, questi OPC derivati da cellule MES diventano eccitabili e generano potenziali d'azione. Vi abbiamo appena mostrato come differenziare cellule staminali embrionali di topo in OPC e generare OPC attivi elettricamente mediante trasduzione virale. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di conservare correttamente l'acido retinoico, la morfina e l'FGF due e di utilizzare sempre aliquote fresche, scartando qualsiasi eccesso di acido retinoico dopo l'uso.
Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la differenziazione di cellule staminali embrionali murine in cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) mediante l'uso di molecole di piccole dimensioni. Il metodo consente di ottenere con elevata efficienza OPC Olig2+NG2+ entro 30 giorni e include una tecnica per produrre OPC attivi elettricamente, in grado di generare potenziali d'azione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ricerca sulle cellule staminali
Sfondo
- Le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) sono fondamentali per la mielinizzazione nel sistema nervoso centrale.
- Le cellule staminali embrionali di topo (cellule ES) possono essere differenziate in OPC per scopi di ricerca e terapeutici.
- I piccoli molecole possono indirizzare efficacemente il processo di differenziazione.
- Comprendere le proprietà delle OPC può migliorare il potenziale terapeutico nelle patologie neurologiche.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per la generazione di OPC da cellule staminali embrionali di topo.
- Indagare le proprietà elettrofisiologiche degli OPC differenziati.
- Esplorare il potenziale degli OPC attivabili elettricamente in applicazioni terapeutiche.
Metodi Utilizzati
- Si formano corpi embrionali da cellule staminali embrionali di topo per avviare la differenziazione.
- Si utilizzano molecole piccole, tra cui acido retinoico e morfina pura, per indurre la differenziazione.
- Le cellule vengono disgregate e coltivate per arricchire la popolazione di OPC.
- La trasduzione virale viene impiegata per introdurre canali del sodio sensibili al voltaggio negli OPC.
Risultati principali
- Circa l'80% delle cellule coltivate viene identificato come OPC dopo 30 giorni.
- La microscopia a immunofluorescenza conferma l'espressione dei marcatori degli OPC.
- Le registrazioni elettrofisiologiche dimostrano le proprietà di generazione di potenziali d'azione negli OPC transdotti.
- Gli OPC non transdotti non mostrano potenziali d'azione, evidenziando l'efficacia del metodo di transduzione virale.
Conclusioni
- Il protocollo genera efficacemente OPC a partire da cellule staminali embrionali di topo.
- La trasduzione virale converte con successo gli OPC in cellule spiking.
- Questo metodo fornisce una base per lo studio degli OPC nel contesto della ricerca neurologica e delle terapie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Una differenziazione efficiente delle cellule staminali embrionali in cellule precursori oligodendrocitiche (OPC) soddisfa un'esigenza fondamentale relativa a fonti cellulari scalabili e compromesse verso una specifica linea cellulare nella ricerca rigenerativa del sistema nervoso centrale. Questo protocollo consente la generazione in alto rendimento di OPC con fenotipo ben definito, supportando un'elevata affidabilità predittiva nella validazione precoce degli obiettivi e negli studi funzionali. L'approccio facilita la riduzione dei rischi meccanicistici e la selezione strategica di portafogli per strategie terapeutiche cellulari rivolte alle malattie demielinizzanti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Permette l'analisi dell'impegno della linea oligodendrogliale e della specificità dei percorsi utilizzando marcatori molecolari definiti.
- Supporta la riduzione del rischio biologico generando OPC con profili di espressione costanti di Olig2 e NG2.
- Facilita la previsione affidabile della validazione funzionale del bersaglio attraverso la caratterizzazione elettrofisiologica delle sottopopolazioni di OPC.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una fonte riproducibile di OPC validati per lo screening di composti e saggi fenotipici successivi.
- Standardizza i risultati della differenziazione, garantendo lo sviluppo di saggi quantitativi e scalabili.
- Consente una valutazione affidabile di molecole candidate in sistemi della linea oligodendrocitaria pertinenti alla malattia.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i modelli di OPC in vitro ai fenotipi derivati da tessuti primari per una continuità traslazionale.
- Permette decisioni di avanzamento a rischio regolato, abilitando studi funzionali su OPC con attività di spiking e senza spiking.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistica per i candidati nella pipeline di terapia cellulare mirati alla demielinizzazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di differenziazione si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo una precoce validazione degli obiettivi, lo sviluppo di saggi e ricerche traslazionali sulla biologia delle OPC.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulle linee di differenziamento e sulle proprietà funzionali delle OPC.
- Screening: Fornisce popolazioni standardizzate e riproducibili di OPC per piattaforme quantitative di saggio.
- Analisi: Offre letture di immunofluorescenza ed elettrofisiologiche per l'analisi comparativa di sottotipi di OPC.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro con modelli di tessuto primario per allinearli alla fase preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro riutilizzabile per la generazione di OPC in diversi programmi di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca incentrata sugli OPC.
- Valore operativo: Fornisce una generazione standardizzata, scalabile e riproducibile di OPC per flussi di lavoro condivisi tra team diversi.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento/cessazione e l'efficienza nell'uso del capitale nei portafogli di terapie cellulari e neuroregenerazione.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio dei candidati terapeutici basati sugli OPC.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, nella differenziazione e nelle tecniche di trasduzione virale.
- Richiede l'accesso a infrastrutture per la microscopia a fluorescenza immunologica e la registrazione elettrofisiologica.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione intergruppo dei protocolli di differenziazione e dei saggi.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse linee di cellule staminali embrionali o modelli specifici per specie.
- Dipende dalla costante qualità dei reagenti e dai tempi precisi dei passaggi di differenziazione.
