Tecniche di Imaging Ca ^{2 +} Segnalazione di sperma umano

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere serie di immagini da spermatozoi umani immobilizzati, marcati con un colorante fluorescente per il calcio. Innanzitutto, le cellule mobili vengono isolate dal plasma seminale mediante risalita attiva nel mezzo di incubazione. Dopo la capacITazione, le cellule vengono marcate con un indicatore fluorescente del calcio, quindi trasferite in una camera di imaging fusa, che viene montata su un microscopio a fluorescenza invertito.

Le risposte della concentrazione degli ioni calcio vengono acquisite come serie di immagini in time-lapse e analizzate per estrarre le risposte a livello di singola cellula. Ciao, sono Edwin Andres Morales Garcia del laboratorio del Dott. Steven J. Public Cova della School of Biosciences dell'Università di Birmingham, Regno Unito. Sono Katherine Nash, anch'io del Public Overlap.

E io sono Jennifer Morris del Public Overlap. Oggi vi mostreremo il procedimento per l'analisi delle risposte intracellulari al calcio nei singoli spermatozoi umani. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la regolazione delle attività spermatiche mediante stimoli derivati dall'ovulo e dal tratto femminile.

Cominciamo. Conservare i campioni di sperma a 37 gradi Celsius per non più di 30 minuti a partire dal momento del prelievo, al fine di isolare le cellule motili dal plasma seminale. Aggiungere un millilitro di soluzione salina equilibrata L'S integrata con BSA allo 0,3% (abbreviata come S-E-B-S-S) in una serie di provette in polistirene da cinque millilitri con fondo rotondo. Sovrapporre delicatamente in ciascuna provetta lo sperma (0,3 millilitri) sotto la S-E-B-S-S e chiudere la provetta con un tappo leggermente allentato.

Incubare le provette ad un angolo di 45 gradi per un'ora a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica. Per consentire alle cellule mobili di nuotare verso l'alto nel S-E-B-S-S, prelevare delicatamente con una pipetta gli 0,7 millilitri superiori di soluzione ed aspirare il liquido da tutte le provette in una provetta da centrifuga pulita da 15 millilitri in polistirene. Agitare delicatamente per mescolare e contare le cellule che sono state immobilizzate con formalina in una nuova camera di conta.

Portare la concentrazione a 6 milioni di cellule per millilitro in S-E-B-S-S e dividere lo sperma in aliquote da 200 microlitri in provette rotonde da 5 millilitri in polistirene. Chiudere i tappi leggermente. Se si sta studiando la risposta di cellule capacitate, incubare le provette per cinque-sei ore a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica per consentire la capacitazione. Applicare 10 microlitri di polilisina al 10% sotto forma di alcune gocce piccole al centro di un vetrino da 22 per 50 millimetri.

Etichettare il primo coprioggetto e lasciarlo asciugare completamente. Utilizzare grasso da vuoto per fissare il coprioggetto con il lato trattato rivolto verso l'alto a una camera per imaging fusa realizzata. A tale scopo.

Per ogni esperimento di imaging, selezionare un singolo tubo di cellule capacitate e aggiungere 1,2 microlitri di organ green dipendente dal calcio al 2,5 milligrammi per millilitro, disciolto in DMSO, per una concentrazione finale di 10 micromolari. Incubare il tubo per 40 minuti a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica.

Utilizzando una pipetta da 200 microlitri Pepto con una punta P 200, rimuovere completamente tutta la soluzione dal tubo. Riempire la camera iniettando delicatamente nel porto di ingresso. Inclinare la camera in modo che le bolle fuoriescano attraverso l'uscita.

Posizionare l'intera camera nell'incubatore e incubare per ulteriori 20 minuti a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica. Per consentire agli spermatozoi di aderire alla poli-D-lisina. Montare la camera sul microscopio a fluorescenza invertito e collegarla all'apparato di perfusione.

Lasciare il preparato al buio per almeno 10 minuti per consentire la rimozione della perfusione. Osservare al microscopio a contrasto di fase a 40 x o 60 x di ingrandimento e scegliere un campo in cui la distanza tra le cellule sia sufficiente per valutare separatamente la fluorescenza di ciascuna cellula. Le cellule devono essere adeguatamente aderenti, ma preferibilmente devono mostrare un chiaro movimento di fledge.

Passare al canale di fluorescenza verde. Mantenere i tempi di esposizione al minimo necessario per ottenere un'immagine fluorescente nitida. Per ridurre il fotobiancamento nel software IQ.

Attivare l'acquisizione di immagini in serie temporale. Acquisire le immagini a 0,1 hertz e utilizzare un otturatore controllato via software per limitare l'illuminazione. Dopo un periodo iniziale di registrazione di controllo della durata di tre-cinque minuti, modificare la concentrazione di calcio nella soluzione salina ed applicare farmaci cambiando la soluzione salina all'ingresso del sistema di perfusione.

Prendere nota del momento in cui ogni stimolo viene aggiunto all'intestazione e calcolare il suo tempo di arrivo nella camera come descritto nella parte scritta di questo protocollo. Per analizzare le immagini offline, utilizzare uno degli strumenti di disegno per delineare una regione di interesse o ROI attorno a ciascuna cellula o parte di una cellula, in questo caso la testa posteriore dello spermatozoo poiché il calcio immagazzinato viene mobilitato in questa zona. Scorrere con la barra di scorrimento per controllare la serie di immagini.

Identifichi e rimuova le cellule che non rimangono completamente all'interno della ROI, che si sovrappongono ad altre cellule o che hanno mostrato un forte e rapido aumento seguito da un netto calo dell'intensità di fluorescenza, caratteristico della morte cellulare. Utilizzi la funzione di analisi per generare una serie temporale dell'intensità di fluorescenza per ciascuna ROI. I dati possono quindi essere esportati e analizzati in un foglio elettronico.

Queste immagini provengono da una serie ottenuta durante la stimolazione con progesterone a tre micromolari. La riga inferiore è stata colorata in falso colore. Per illustrare meglio le variazioni relative di intensità, qui è stato introdotto il progesterone nella camera. Qui.

Questi risultati sono mostrati in un video time-lapse. Osservare il rapido picco di intensità della fluorescenza seguito da un aumento lento, che indica le corrispondenti variazioni nei livelli di calcio intracellulare. Questi dati sono quantificati qui a partire dalle intensità medie della regione posteriore della testa di tre cellule.

Sono stati aggiunti tre micromoli di progesterone al momento indicato dalla freccia. La linea tratteggiata mostra la fluorescenza media del controllo. Oggi vi abbiamo mostrato come isolare cellule di buona qualità, carificarle con un colorante sensibile al calcio e monitorare la risposta di singole cellule alla stimolazione.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare la popolazione cellulare migliore possibile, ridurre al minimo l'illuminazione delle cellule per evitare danni fotoindotti e scegliere il colorante più adatto alle risposte che si stanno analizzando. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.