Isolamento linfociti T umani, la cultura e l'analisi delle migrazioni In Vitro

La migrazione dei linfociti T avviene durante l'omning verso organi linfoidi, l'uscita dal circolo vascolare e l'ingresso nei tessuti periferici. Questo processo implica l'interazione adesiva della superficie del linfocita T con altre cellule. Per esaminare questo fenomeno in vitro, i linfociti T umani vengono isolati, coltivati e posti su piastre per colture cellulari rivestite con la proteina adesiva.

ICAM-1 e chemochina SDF-1. Possono quindi essere acquisite e analizzate immagini della migrazione dei linfociti T. Ciao, sono Craig LeFort e del laboratorio di Minsu Kim del Centro di Biologia dei Vaccini e Immunologia presso l'Università di Rochester.

Oggi vi mostreremo un procedimento per l'isolamento e la coltura di linfociti umani da adolescenti, nonché un'analisi della loro migrazione in vitro. Utilizziamo questo saggio nel nostro laboratorio per studiare il ruolo degli integrini e della migrazione dei linfociti T. L'integrina principale nei linfociti T è l'antigene associato alla funzione linfocitaria uno, o LFA-1.

I ligandi specifici per LFA-1 sono le ICAM, come ICAM-1. Inoltre, è necessario un segnale chimico per la migrazione dei linfociti T, che fornisce sia un segnale di direzionalità sia l'attivazione degli integrini. Nel nostro saggio, utilizziamo ICAM-1 umana e CXCL12 o SDF-1 come substrati per la migrazione dei linfociti T.

Iniziamo. Dopo aver ottenuto sangue umano da un donatore sano, lasciare che il sangue si raffreddi a temperatura ambiente. Questo richiede circa 30 minuti.

Una volta raffreddato il sangue, pipettare delicatamente tre millilitri di mezzo di gradiente di densità per polimorfi a temperatura ambiente in un tubo conico in polistirene da otto millilitri. Successivamente, aggiungere delicatamente tre millilitri di sangue intero in cima. È importante evitare qualsiasi mescolamento.

Posizionare i tubi in una centrifuga ed eseguire la centrifugazione a 500 G per 45 minuti. A temperatura ambiente, al termine della centrifugazione, le cellule mononucleate del sangue periferico o PBMC sono state separate dagli altri componenti del sangue. Lo strato di PBMC appare come la prima banda torbida partendo dall'alto.

In condizioni sterili, rimuovere con attenzione e scartare la fase superiore di colore giallo chiaro. Successivamente, utilizzare una micropipetta P 1000 per trasferire lo strato di PBMC in un nuovo tubo conico. Lavare i PBMC due volte con PBS centrifugando le cellule a 500 G per cinque minuti.

Ogni volta, il sopranatante sarà leggermente torbido dopo ogni lavaggio. Ripesare le cellule in 20 millilitri di terreno RPMI 1640 contenente 10% di FBS, 1% di penicillina-streptomicina e un microgrammo per millilitro di fitoemagglutinina o PHA. L'incubazione in presenza di PHA induce l'attivazione e l'espansione dei linfociti T.

Utilizzando una pipetta, trasferire i PBMC in una fiasca da coltura T 75. Successivamente, incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per uno a 24 ore. Questo passaggio consente di separare i monociti, che aderiranno alla superficie della fiasca, dai linfociti che rimangono in sospensione.

Al termine dell'incubazione, rimuovere con attenzione tutto il mezzo contenente principalmente linfociti e trasferirlo in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare a 500 G per cinque minuti. Sospendere il pellet cellulare in RPMI 1640 e trasferire le cellule in una nuova fiasca T75 contenente 25 millilitri di RPMI 1640 con FBS, penicillina, streptomicina e PHA, incubata a 37 gradi Celsius.

Dopo 24 ore di crescita, potrebbe essere necessario aggiungere da 15 a 20 millilitri di mezzo fresco e trasferire in una fiala T175 più grande. Continuare l'incubazione per tre giorni o due giorni. Se l'incubazione iniziale dei PBMC è stata notturna dopo tre giorni, utilizzare una pipetta per rimuovere il mezzo, che conterrà linfociti in sospensione, e trasferirlo in un tubo conico da 50 millilitri da centrifugare a 500 ×g per cinque minuti.

Reese ha centrifugato il pellet cellulare e ha trasferito le cellule in un nuovo flacone T 75 contenente 25 millilitri di RPMI 1640. Con FBS, penicillina, streptomicina e IL-2 umana o IL-15, posizionare le cellule nell'incubatore. Se si inizia con un flacone T 75, la coltura dovrà essere espansa e trasferita in un flacone T 175.

Dopo uno o due giorni, coltivare i linfociti per un totale di quattro a sette giorni. Un giorno prima del saggio di migrazione, rivestire una piastra con fondo in vetro da 0,17 millimetri con 20 microgrammi per millilitro di proteina A o G in PBS, incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Lavare abbondantemente la piastra con PBS, quindi aggiungere nel piatto ICAM one FC e human SD F1 in soluzione PBS.

Incubare per quattro ore a temperatura ambiente per immobilizzare le molecole. Determinare la densità delle cellule coltivate utilizzando un emocitometro. Quindi lavare i linfociti due volte con PBS e risospendere in un millilitro di mezzo L 15 contenente D glucosio. Al termine dell'incubazione, lavare accuratamente la piastra rivestita con ICAM one FC e SDF one con PBS. Trasferire i linfociti T in un millilitro di mezzo nella piastra; dovrebbero essere utilizzate circa da due a cinque volte 10 alla quinta cellula per piastra, per ottenere una densità cellulare adeguata all'analisi della migrazione.

Per ottenere immagini della migrazione cellulare, posizionare la piastra sul palchetto del microscopio in un ambiente controllato per la temperatura, ad esempio in una camera riscaldata a 37 gradi Celsius. Aprire il software NIS Elements nel menu delle impostazioni dell'immagine. Selezionare il modo di binning 2x2 sia per l'acquisizione in tempo reale sia per la cattura dell'immagine.

Vai al menu delle applicazioni e scegli, definisci ed esegui l'esperimento. Scegli l'intervallo di tempo tra le immagini e il tempo totale. Per la sequenza di acquisizione delle immagini, premi il pulsante di esecuzione per iniziare l'acquisizione delle immagini dopo l'acquisizione.

I parametri di migrazione come velocità, lunghezza del percorso e spostamento possono essere quantificati utilizzando un pacchetto software come Image J Auto Quant o veloc. Per generare un grafico a ragnatela, raccogliere le coordinate XY per ogni cellula e punto temporale e proiettarle su un grafico con un punto di partenza comune per ciascuna cellula nell'origine. I linfociti T mostrati qui sono stati coltivati su ICAM e SDF uno e immaginati ogni 10 secondi per 30 minuti.

Questo filmato mostra la migrazione casuale di linfociti T a una velocità di circa 15 micron al minuto, utilizzando le coordinate XYT per ogni cellula. Sono state scelte casualmente 15 cellule e riportate su un punto iniziale comune nell'origine. Il confronto tra grafici a ragnatela fornisce una rappresentazione visiva immediata delle differenze nella migrazione tra diverse condizioni sperimentali.

I grafici relativi alla migrazione dei linfociti T in condizioni di controllo sono mostrati a sinistra, mentre quelli relativi alla migrazione dei linfociti T in presenza di un anticorpo bloccante del ligando anti-LFA-1 sono mostrati a destra. Questi dati dimostrano che i linfociti T utilizzano l'integrina LFA-1 per migrare su un substrato di ICAM-1. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire un saggio di migrazione utilizzando linfociti T umani coltivati durante la procedura.

È importante ricordare di aggiungere un numero appropriato di cellule alla piastra rivestita con ICAM-1 in modo da semplificare il tracciamento cellulare e l'analisi della migrazione. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.