Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l'embriogenesi

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare se due geni sono funzionalmente ridondanti per la specificazione di una linea cellulare definita. Questo viene raggiunto innanzitutto definendo il fenotipo da perdita di funzione di ciascun gene singolo, utilizzando morpholino specifici per il gene iniettati in embrioni di pesce zebra in via di sviluppo. Il secondo passaggio della procedura consiste nello sviluppare un saggio per quantificare la specificazione o la differenziazione della linea cellulare.

Ad esempio, utilizzando una linea di pesci reporter, come mostreremo qui. Il terzo passaggio della procedura consiste nel combinare due morph FENO per mirare la perdita di funzione di entrambi i geni contemporaneamente. L'ultimo passaggio della procedura è valutare il fenotipo causato dall'abbattimento doppio.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano una perdita o un guadagno di funzione per le cellule di una specifica linea cellulare, attraverso l'esame del reporter della linea cellulare o l'analisi dell'espressione di marcatori specifici per la linea. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la combinazione di knockout nel modello murino, è che nel modello del pesce è possibile indirizzare due o persino tre geni semplicemente combinando morpholini validati in un singolo esperimento. È possibile iniettare oltre 100 embrioni e valutare i fenotipi nell'arco di diversi giorni.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali. In biologia dello sviluppo, ad esempio nella definizione delle vie trascrizionali che controllano il destino cellulare, le vie regolatorie chiave sono spesso rappresentate da piccole famiglie di geni correlati che sono funzionalmente ridondanti. Il loro ruolo pertanto non è evidente negli studi di knockout nei topi a causa del compenso da parte dei geni omologhi.

Sebbene questo modello possa fornire informazioni sull'embriogenesi del pesce zebra, i risultati possono essere applicati ad altri sistemi come il topo, poiché gli stessi programmi genetici sono generalmente ben conservati durante l'evoluzione. Preparare le piastre per microiniezione prima di iniettare gli embrioni. Versare circa 12 millilitri di agar al 2% in acqua del sistema, ovvero acqua pulita prelevata direttamente dal sistema dell'acquario, nel coperchio capovolto di una piastra di Petri da 100 millimetri.

Posizionare due vetrini a un angolo di circa 45 gradi sui due lati del coperchio. Una volta che l'agarosio si è solidificato, rimuovere delicatamente i vetrini dal coperchio, creando delle scanalature in cui gli embrioni si adageranno durante l'iniezione. I morpholino vengono conservati a temperatura ambiente a una concentrazione di un millimolare in acqua distillata deionizzata sterile prima dell'iniezione. Incubare le soluzioni di morpholino a 65 gradi Celsius per cinque minuti per assicurarsi che siano completamente in soluzione.

Lasciare raffreddare le soluzioni madri a temperatura ambiente. Ogni nuovo morpholino progettato deve essere convalidato empiricamente per l'attività e la tolleranza da parte dell'embrione. In provette da microcentrifuga, effettuare un'opportuna diluizione seriale del morpholino madre in acqua deionizzata distillata, ottenendo concentrazioni di lavoro di un millimolare, 0,5 millimolare, 0,25 millimolare e 0,125 millimolare.

Sotto una lente stereoscopica, utilizzare l'aspirazione per caricare anteriormente un ago di iniezione calibrato, collegato al micromanipolatore e posizionato correttamente. Caricare l'ago con circa un microlitro della soluzione di morpho alla concentrazione più bassa. Utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare gli embrioni fecondati a una sola cellula nelle depressioni della piastra per microiniezione.

Utilizzare la pipetta per rimuovere l'acqua in eccesso dalla piastra in modo che gli embrioni cadano sul fondo della scanalatura. Posizionare la piastra per iniezione sotto il microscopio, abbassare l'ago attraverso il corione e all'interno del tuorlo. Iniettare ciascun embrione prima di rimuovere l'ago e riposizionare la piastra per iniezione per accedere all'embrione successivo.

Quando si impara a eseguire le iniezioni, può essere utile utilizzare un colorante vitale per visualizzare l'iniezione all'interno della cellula, come mostrato qui; trasferire quindi gli embrioni in una piastra di Petri da 100 millimetri con acqua di sistema e coltivarli a 28,5 gradi Celsius. Espellere qualsiasi soluzione di morpho residua dall'ago e riempirlo con la successiva concentrazione più alta di morpho per iniettare il prossimo lotto di embrioni allo stadio di sviluppo appropriato. Esaminare gli embrioni per i fenotipi a ciascuna concentrazione di morpho iniettata.

La dose soglia per ciascun morfo è la dose più bassa alla quale si osserva un fenotipo definito e affidabile. Potrebbero essere necessari più cicli di titolazione per definire con precisione la soglia. Per ricercare un'interazione genetica tra due geni distinti.

Preparare una miscela di due morpho di interesse, ciascuno alla rispettiva concentrazione soglia. È importante tenere presente che gli embrioni potrebbero non tollerare più di 20 nanogrammi di morpho totali per iniezione. Iniettare gli embrioni nello stesso modo di prima.

Mantenere costanti i volumi di iniezione tra i gruppi sperimentali e di controllo, che dovrebbero includere serie di campioni iniettati con ciascun morpholino singolarmente sotto il microscopio stereoscopico. Monitorare immediatamente dopo l'iniezione e più volte durante la giornata gli embrioni iniettati; utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere gli embrioni morti o morenti. Poiché questi potrebbero compromettere la vitalità degli embrioni rimanenti, spostare con una pipetta di trasferimento gli embrioni sedati o eutanasizzati in qualsiasi momento.

Indicare un vetrino con depressione per l'osservazione. Per la fotografia, utilizzare pinzette affilate per rimuovere la coriona, se necessario.

Stabilizzare l'embrione in una goccia di metilcellulosa al 3% e analizzare gli embrioni alla ricerca di un fenotipo distinto, specifico per la combinazione di morpholino, piuttosto che per una maggiore penetranza del fenotipo osservato con singoli morpholino. Qui sono mostrati diversi embrioni di tipo selvatico iniettati con morpholino alla soglia. Per gata5, il fenotipo tipico è il cardio bifida o due cuori, poiché i progenitori non si sono fusi lungo la linea mediana.

Osservare i cardiomiociti GFP positivi indicati dalle frecce. Il fenotipo per sei morfologie include cuori malformati che non si sviluppano correttamente in senso longitudinale. Anche questi embrioni sviluppano cardiomiociti GFP positivi.

Tuttavia, gli embrioni iniettati con una combinazione di entrambi i morpholino di gata five e gata six mostrati qui esibiscono una perdita totale dello sviluppo dei cardiomiociti, indicando che è necessaria l'espressione di almeno uno tra gata five o gata six affinché i cardiomiociti possano svilupparsi. I due geni sono funzionalmente ridondanti nella specificazione dei cardiomiociti.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante validare completamente i morfosi e accertarsi il più possibile che rappresentino un effettivo silenziamento del singolo gene bersaglio. A seguito di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la combinazione di alleli nulli condizionali nei topi, al fine di dimostrare che gli stessi geni svolgono funzioni analoghe anche nei mammiferi.

Dopo aver guardato il video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare se due geni sono funzionalmente ridondanti durante l'embriogenesi.