Preparazione del tessuto cerebrale del mouse per la microscopia Immunoelectron
20 luglio 2010
Abbiamo descritto un protocollo per la perfusione transcardiac di topi, rimozione e sezionamento del cervello, così come colorazione immunoperossidasi, incorporando resina, ultrasottili e sezionamento delle sezioni cervello. Al termine di queste procedure, il materiale immunostained è pronto per l'esame con microscopia elettronica a trasmissione.
L'obiettivo generale di questa procedura è preparare il tessuto cerebrale di topo per la microscopia elettronica immunoistochimica. Questo viene ottenuto innanzitutto fissando il cervello mediante perfusione dell'animale. Il secondo passaggio della procedura consiste nel tagliare il cervello ed elaborare le sezioni per l'immunohistochimica.
Il terzo passaggio della procedura consiste nell'ossecare, disidratare e incorporare le sezioni. L'ultimo passaggio della procedura è il taglio di sezioni ultrasottili. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano, con elevata risoluzione spaziale, la distribuzione di diverse proteine all'interno di diverse regioni e tipi cellulari del sistema nervoso centrale.
Ciao, sono Maria Trombley del Laboratorio di Esca presso il Dipartimento di Neurobiologia e Anatomia dell'Università di Rochester. Oggi vi mostreremo un procedimento per la preparazione del tessuto cerebrale di topo per la microscopia elettronica immunoistochimica. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le interazioni tra microglia e sinapsi durante lo sviluppo, la plasticità dipendente dall'esperienza e l'invecchiamento.
Iniziamo. Dopo aver fissato il cervello del topo mediante perfusione intracardiaca, postfissarlo in circa 10 millilitri di formaldeide a quattro gradi Celsius per due ore. Lavare il cervello a quattro gradi Celsius, una volta in PBS 1X per 3 volte, 10 minuti per ogni lavaggio, utilizzando un vibratome e PBS 1X freddo su ghiaccio; quindi sezionare immediatamente il cervello in sezioni trasversali di 50 micron.
Utilizzare un pennello sottile per trasferire le sezioni selezionate in un vial di vetro contenente soluzione tampone salina fosfato X (XPBS) a quattro gradi Celsius. Conservare le sezioni rimanenti nel crioprotettore a meno 20 gradi Celsius per un periodo fino a diversi anni senza alterazioni. Elaborare al massimo 10 sezioni libere per la colorazione in ciascun vial di vetro.
Utilizzare una pipetta Pasteur per sostituire il PBS con del PBS fresco contenente 0,1% di boroidruro di sodio, cambiando rapidamente le soluzioni per evitare che i preparati si secchino. Incubare per 30 minuti, quindi risciacquare i preparati con PBS per 3 volte, 10 minuti ciascuna. Avere cura di rimuovere tutte le bolle e bloccare con PBS contenente 0,5% di gelatina e 5% di siero normale, appropriato per l'anticorpo secondario che verrà utilizzato.
Incubare per due ore. Aggiungere l'anticorpo primario diluito nella soluzione di blocco. Incubare per 48 ore.
Lavare con una XPB S per 3 volte di 10 minuti ciascuna. Incubare ogni volta con un anticorpo secondario coniugato alla biotina diluito nella soluzione di blocco per due ore. Lavare nuovamente tre volte per 10 minuti in una XPBS come in precedenza.
Incubare con streptavidina perossidasi diluita nella soluzione di blocco per un'ora. Risciacquare le sezioni una volta in XPBS e due volte in XTBS per 10 minuti ciascuna. Per rivelare l'etichettatura, incubare le sezioni con una soluzione appena preparata contenente 0,05% dab e 0,01% perossido di idrogeno in XTBS.
Quando la colorazione appare marrone scuro o la reazione è durata cinque minuti, sciacquare le sezioni con un XTBS per arrestare la reazione. Successivamente, sciacquare una volta con un XTBS e due volte con un x PB per 10 minuti ciascuno. In una cappa, utilizzare un pennello fine per trasferire le sezioni in una piastra per colture multipozzetto riempita con un XPB.
Rimuovere il PB da una pozzetta utilizzando un pennello fine per stendere immediatamente i campioni in piano. Aggiungere una soluzione di tetroxido di osmio all'1% in un x PB prima di passare alla pozzetta successiva, incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Trasferire le sezioni con OSM in vial di vetro.
Risciacquare con un XPB per tre volte da 10 minuti ciascuna. Disidratare i preparati in concentrazioni crescenti di etanolo. Successivamente, utilizzare l'ossido di propilene come descritto nella parte testuale del presente protocollo.
Utilizzare un pennello sottile risciacquato in ossido di propilene per trasferire le sezioni nella resina dupant appena preparata. Per l'impregnazione notturna, collocare la piastra contenente le sezioni in un forno a 55 gradi Celsius per 10 minuti. Per ammorbidire la resina, utilizzare un pennello risciacquato con ossido di propilene per ricoprire un film di inclusione in clor con uno strato sottile di resina.
Trasferire il campione sul film e coprirlo con un altro film di inclusione, distribuendo uniformemente dei pesetti di circa due grammi sulla superficie per favorire la diffusione della resina. Lasciare polimerizzare la resina a 55 gradi Celsius per 48-72 ore in un incubatore. Al termine della polimerizzazione, rimuovere i pesetti dallo strato superiore del film di inclusione al microscopio binoculare.
Selezionare aree di interesse di due per due millimetri e utilizzare una lametta per escinderle dal film. Incollare con colla istantanea le aree di interesse alle punte dei blocchetti di resina. Incubare a 55 gradi Celsius per un'ora.
Utilizzare una lametta per tagliare il blocco di resina in modo da ottenere la forma di un trapezio isoscele, la forma ottimale per l'aspirazione ultra sottile. Utilizzando un microtomo e un coltello di vetro, rimuovere la colla dalla superficie del tessuto per ottenere una superficie piana. Per l'aspirazione.
Riempire la barchetta del coltello di vetro con acqua doppio-distillata e tagliare alcune sezioni comprese tra 0,5 e un micron. Utilizzare un'ansa perfetta per trasferire le sezioni su un vetrino super frost. Asciugare su una piastra riscaldata a 80 gradi Celsius per un minuto e colorare con blu di toluidina 0,1% per un minuto.
Utilizzare una bottiglia spray per rimuovere con acqua bidistillata l'eccesso di colorante. Al microscopio ottico, esaminare le sezioni per distinguere il tessuto colorato dalla resina. Tagliare sezioni semisottili finché il confine tra tessuto e resina non raggiunge approssimativamente il centro della sezione. Sostituire il coltello di vetro con un coltello al diamante e riempire la barca con acqua bidistillata.
Tagliare l'argento in sezioni sottilissime di colore argento-oro. Preparare sezioni spesse da 60 a 80 nanometri. Utilizzare pinzette fini invertite per raccogliere con cura le sezioni su griglie di rame a maglie fini.
Asciugare le griglie sulla carta filtro per migliorare il contrasto. Utilizzare pinzette fini invertite per trasferire una griglia su una goccia di citrato di piombo per due minuti. Risciacquare delicatamente la griglia immergendola in tre bagni successivi di acqua doppio-distillata.
Asciugare la griglia su carta filtro e conservarla in una scatola per griglie per un successivo esame al microscopio elettronico. Esaminare le griglie al microscopio elettronico per visualizzare la marcatura immunoistochimica, ma anche la morfologia degli elementi cellulari, inclusi gli organelli intracellulari e le loro relazioni reciproche.
Qui, viene mostrata un'immunomarcatura rappresentativa per IBA one a livello microscopico ottico. La distribuzione cellulare di IBA one è limitata ai microglia, il che ne conferma la specificità a livello microscopico elettronico. IBA one, microglia marcati immunologicamente con pericarione e processi sono visibili.
La colorazione immunoperoxidasi con DAB appare come un precipitato elettrondenso. Altri esempi di IBA1, processi microgliali immuno marcati mostrano dimensioni e forme diverse. Un ingrandimento maggiore rivela diverse organelle intracellulari all'interno di uno dei processi microgliali e anche le relazioni ultrastrutturali tra un altro processo microgliale ed elementi vicini del neuropillo, inclusi i sinapsi.
Abbiamo appena mostrato come preparare il tessuto cerebrale di topo per la microscopia elettronica immunoistochimica. Durante questa procedura, è importante ricordare di seguire rigorosamente tutti i passaggi e di manipolare il tessuto cerebrale con delicatezza. Questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo protocollo descrive i passaggi per la preparazione del tessuto cerebrale di topo per la microscopia elettronica immunoistochimica. Include la perfusione transcardiaca, il taglio del cervello in sezioni e la colorazione con immunoperossidasi.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Istologia
- Immunoistochimica
Sfondo
- Comprendere la distribuzione delle proteine nel sistema nervoso centrale è fondamentale per la ricerca in neuroscienze.
- La microscopia elettronica immunoistochimica fornisce immagini ad alta risoluzione spaziale.
- Una corretta preparazione del tessuto cerebrale è essenziale per ottenere risultati accurati.
- Questo protocollo è stato ideato per ricercatori che lavorano con modelli murini.
Scopo dello studio
- Preparare il tessuto cerebrale di topo per un esame dettagliato.
- Visualizzare la distribuzione delle proteine in diverse regioni cerebrali.
- Potenziare la comprensione delle strutture cellulari nel sistema nervoso centrale.
Metodi Utilizzati
- Perfusione transcardiaca per fissare il cervello.
- Sezionamento del cervello per immunohistochemica.
- Inclusione e disidratazione delle sezioni cerebrali.
- Taglio di sezioni ultrasottili per microscopia elettronica.
Risultati principali
- Tessuto cerebrale preparato con successo per la microscopia elettronica immunoistochimica.
- Ottenute immagini ad alta risoluzione che mostrano la distribuzione delle proteine.
- Dimostrata l'efficacia del protocollo descritto.
- Fornite informazioni dettagliate sulle strutture cellulari del sistema nervoso centrale.
Conclusioni
- Il protocollo è efficace per la preparazione del tessuto cerebrale di topo.
- La microscopia elettronica immunoistochimica può rivelare una localizzazione proteica dettagliata.
- Questo metodo può essere applicato a vari studi nel campo delle neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente una visualizzazione ad alta risoluzione della localizzazione proteica nel tessuto cerebrale del topo, supportando la validazione del bersaglio e la riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze. Combinando l'immunocitochimica con la microscopia elettronica a trasmissione, i ricercatori possono valutare con precisione la distribuzione subcellulare dei bersagli terapeutici, fornendo informazioni utili per la verifica delle ipotesi nelle fasi iniziali e per la priorizzazione del portafoglio. Il metodo aumenta la fiducia predittiva negli studi sull'interazione con il bersaglio e sulla modulazione del percorso.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione dell'espressione proteica in specifici compartimenti neuronali e gliali.
- Valore operativo: Fornisce una conferma ultrastrutturale della specificità dell'anticorpo e del legame al bersaglio in tipi cellulari definiti.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica risolvendo le associazioni con organelli intracellulari e le relazioni sinaptiche delle proteine bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera preparati di tessuto standardizzati e riproducibili, adatti per lo screening immunohistochimico quantitativo.
- Output quantitativo: Consente la misurazione della densità proteica e della localizzazione ultrastrutturale in dendriti, assoni e sinapsi.
- Riutilizzo della piattaforma: Stabilisce un flusso di lavoro validato per valutare la distribuzione del bersaglio in diverse regioni cerebrali e modelli di malattia.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Facilita l'esame delle alterazioni del bersaglio in modelli di neurodegenerazione e sviluppo neurologico.
- Continuità traslazionale: Collega i risultati molecolari dalla scoperta alla validazione ultrastrutturale in sistemi preclinici.
- Decisioni basate sul rischio: Informa i criteri di prosegui/non-prosegui rivelando legami fuori bersaglio o localizzazioni cellulari inattese.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio alla validazione preclinica, consentendo un affinamento iterativo dei candidati terapeutici in base ai dati sulla distribuzione subcellulare delle proteine.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi rivelando l'espressione del bersaglio in microglia, astrociti, neuroni e domini subcellulari.
- Screening: Fornisce risultati immunohistochimici quantitativi e riproducibili per confrontare l'interazione con il bersaglio in diverse condizioni.
- Analisi: Offre letture spaziali ad alta risoluzione che aiutano i team a correlare la localizzazione delle proteine con esiti funzionali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro all'architettura tissutale integra, favorendo l'allineamento dei biomarcatori e la validazione meccanicistica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la caratterizzazione di bersagli del sistema nervoso centrale in progetti multipli e aree terapeutiche diverse.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica e chiarimento del coinvolgimento delle vie.
- Valore operativo: Standardizzazione della preparazione dei tessuti, riproducibilità tra sezioni e scalabilità per lo screening multiplo di bersagli.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale grazie alla riduzione precoce dei rischi e riduzione del rischio di fallimento biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei bersagli corretta per il rischio in base ai modelli di espressione subcellulare validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella fissazione per perfusione, nell'immunohistochimica e nelle tecniche di microscopia elettronica.
- Presuppone l'accesso a microtomi, ultramicrotomi e microscopi elettronici a trasmissione.
- Necessita della standardizzazione della validazione degli anticorpi, delle condizioni di bloccaggio e dei controlli della reazione con DAB tra diversi gruppi di lavoro.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse regioni cerebrali, stadi di sviluppo e modelli di malattia.
- È limitato dalla reperibilità del tessuto, dagli artefatti di fissazione e dalla necessità di un'accurata manipolazione per preservare l'ultrastruttura.
