Modelli sperimentali per lo Studio di Fisiologia dell'epitelio pigmentato retinico e fisiopatologia
6 novembre 2010
Forniamo un metodo riproducibile per la coltura monostrati confluenti di cellule fetali dell'epitelio pigmentato retinico (hfRPE), le cellule che presentano morfologia, fisiologia, polarità e proteine e schemi di espressione genica dei tessuti adulti nativi. Questo lavoro è stato esteso ad un modello animale di malattie degli occhi diversi.
L'obiettivo generale di questa procedura è generare colture di epitelio pigmentato retinico fetale umano, o RPE, utilizzabili come modello. Nelle indagini sulle malattie oculari umane, i tessuti vengono ricevuti da donatori sotto forma di globi oculari integri. Il primo passaggio della procedura consiste nell'asportare i muscoli e i tessuti connettivi in eccesso, quindi aprire l'occhio rimuovendo la cornea e il cristallino.
L'occhio viene trattato con dispa e appiattito, quindi il monolayer di epitelio pigmentato retinico (RPE) viene staccato dalla coroide. Il RPE isolato viene seminato in fiasche e coltivato per diverse settimane fino al raggiungimento di monolayer confluenti e allo sviluppo del pigmento. Le colture cellulari vengono utilizzate in esperimenti funzionali in vitro.
Gli esperimenti in vitro di successo vengono ripetuti in modelli animali di prova preclinica, in cui le risposte dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) possono essere valutate meglio in ambienti di segnalazione più complessi. Il modello qui descritto porterà a una migliore comprensione della fisiologia dell'RPE e a nuovi interventi terapeutici per il trattamento delle malattie oculari. Ciao, mi chiamo Sheldon Miller.
Il mio laboratorio si trova presso l'Istituto Nazionale per la Salute degli Occhi, che fa parte degli Istituti Nazionali della Salute nel campus di Bethesda, Maryland. Ciao, sono Arki del Miller Lab. Oggi vi mostreremo un procedimento per la preparazione di colture primarie di cellule epiteliali pigmentate retiniche fetali umane.
Queste cellule verranno preparate come monocapati confluenti che possono essere montati in camere per singoli utilizzate in forma modificata. Utilizzeremo anche queste cellule RPE umane isolate per studi di biochimica e genetica. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per stabilire colture primarie di cellule epiteliali al fine di studiare la funzione e la regolazione di processi fisiologici e patofisiologici e sviluppare modelli animali clinici di malattie.
Ci concentriamo sull'epitelio pigmentato retinico o RPE, che si trova nella parte posteriore dell'occhio, separando la retina neurale e l'afflusso sanguigno corioideo. Questo diagramma schematico dell'occhio mostra la posizione del foglietto RPE nella parte posteriore dell'occhio, proprio adiacente ai fotoricettori. L'insetto mostra le cellule della retina con i fotoricettori a destra e le cellule gangliari a sinistra.
Questo epitelio è estremamente attivo dal punto di vista metabolico. Fagocita continuamente i fotorecettori su base circadiana, e immagazzina, modifica e trasporta il pigmento visivo vitamina A ai fotorecettori. Nel ciclo visivo, agisce in modo omeostatico per mantenere la composizione chimica e il volume degli spazi extracellulari circostanti.
Una proprietà fondamentale degli epiteli è la loro polarità. Il costante trasporto asimmetrico di proteine verso le membrane apicali e basolaterali è un processo regolato che consente all'epitelio di effettuare il traffico vettoriale di metaboliti, ioni e fluidi da uno spazio extracellulare all'altro. Questa attività aiuta l'epitelio a mantenere la salute e l'integrità della retina neurale.
Il preparato in vitro che descriviamo qui consente l'analisi di proteine di trasporto, recettori e vie di segnalazione che determinano la polarità e la funzione epiteliale prima di iniziare la dissezione. Preparare una piastra a 12 pozzetti in una cappa a flusso laminare con soluzioni a temperatura ambiente. Ogni occhio richiede un pozzetto di soluzione antibiotica antimicotica 10x, due pozzetti di XPBS e un pozzetto di due unità per millilitro di spazio disco diluite in mezzo RPE al 5% con siero. Riempire una bacinella da dissezione foderata con silicone con X-H-B-S-S, eliminare il liquido e trasferire ciascun occhio in un pozzetto di soluzione antibiotica antimicotica.
Incubare per tre-cinque minuti a temperatura ambiente. Evitare di applicare pressione eccessiva sul bulbo oculare. Sciacquare l'occhio in due pozzetti successivi di un XPBS per rimuovere l'antibiotico in eccesso.
Quindi utilizzare una pinzetta per trasferirlo nella piastra per dissezione riempita con X-H-B-S-S 1X sotto un microscopio stereoscopico per dissezione. Utilizzare forbici da iridectomia per rimuovere l'eccesso di muscolo e tessuto connettivo intorno all'occhio. Posizionare l'occhio in modo che la cornea sia rivolta verso l'alto.
Usare due aghi sterili da 27 gauge per fissare l'occhio al pad di silicone tramite il tessuto connettivo, senza danneggiare la sclera. In questa orientazione, utilizzare un bisturi per fori laterali per praticare un'incisione attraverso la sclera. Il taglio deve trovarsi a un terzo della distanza tra l'equatore oculare e la superficie anteriore.
Utilizzare forbici da iridectomia per proseguire il taglio in modo circolare attorno all'occhio, evitando danni all'epitelio pigmentato retinico, abbreviato RPE a causa dell'attrazione della retina con il corpo vitreo. Utilizzare le stesse forbici per tagliare attraverso il corpo vitreo e separare la parte anteriore dell'occhio dalla coppa oculare.
Sollevare la porzione anteriore dell'IOA e scartarla. Utilizzare pinzette per trasferire l'occhio aperto nel pozzetto della piastra. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nell'occhio.Cup.
Incubare per 40-60 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Trasferire l'occhio dal piatto di dissezione alla capsula di dissezione, precedentemente riempita con soluzione X-H-B-S-S fresca a temperatura ambiente. Posizionare l'occhio con la coppa rivolta verso l'alto e fissarla con 2 aghi da 27 gauge.
Sotto il microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette fini per sollevare delicatamente la retina parzialmente separata con forbici per retina. Recidere la retina dal nervo ottico. Scartare la retina con le forbici per iride.
Eseguire un'incisione dalla periferia dell'occhio fino al nervo ottico. Fissare l'occhio con 5 aghi da 27 gauge. Per stirare il livello dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), utilizzare forbici retiniche per effettuare un taglio circolare intorno al nervo ottico.
Separare il foglio dell'epitelio pigmentato retinico passando a un ingrandimento di 250x o superiore. Individuare il bordo del foglio dell'epitelio pigmentato retinico lungo il taglio effettuato con le forbici per iridectomia e vicino al nervo ottico. Utilizzare due paia di pinze per staccare l'epitelio pigmentato retinico e la membrana di Bruch dallo strato del tessuto corioideo.
Prova diverse aree lungo il bordo tagliato per individuare dove il collegamento tra l'epitelio pigmentato retinico (RPE) e la coroide è più debole. Stacca delicatamente la membrana all'indietro per rimuoverla completamente. Posiziona i fogli di RPE in un tubo conico da 15 millilitri riempito con tripsina a temperatura ambiente in EDTA.
Dopo aver raccolto tutti i fogli, chiudere il tubo con il tappo e incubare i tubi in un bagno termico per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Agitare vigorosamente il tubo per separare l'epitelio pigmentato retinico (RPE) in piccoli aggregati. L'assenza di grumi scuri indica che la separazione è completa.
Riportare il tubo nel bagnomaria per altri cinque minuti. Utilizzare un puntale, una pipetta e una leggera aspirazione per rimuovere eventuali residui di tessuto non digerito. Centrifugare le cellule a 280 ×g per quattro minuti.
Rimuovere il soprannatante. Portare il volume finale a nove millilitri con mezzo RPE al 15% utilizzando una pipetta per risospendere. Pipettare tre millilitri della sospensione cellulare in un’area di coltura da 25 centimetri quadrati.
Aggiungere due millilitri di mezzo di coltura RPE fresco al 15% a temperatura ambiente. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Maturando le colture, la loro pigmentazione aumenterà dopo tre o quattro settimane.
Le colture di successo saranno confluenti e uniformemente, intensamente pigmentate. Abbiamo appena mostrato come preparare colture primarie di RP fetale umano. Ecco fatto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo riproducibile per la coltivazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche fetali umane (hfRPE) che mimano le caratteristiche del tessuto nativo adulto. Le cellule coltivate vengono utilizzate in studi relativi a varie malattie oculari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Oftalmologia
Sfondo
- L'epitelio pigmentato retinico (RPE) fetale umano svolge un ruolo fondamentale nella salute oculare.
- Le cellule RPE sono coinvolte nel ciclo visivo e nel mantenimento dell'integrità retinica.
- Comprendere la fisiologia del RPE è essenziale per lo sviluppo di interventi terapeutici per le malattie oculari.
- I metodi attuali per lo studio del RPE sono limitati dalla disponibilità di modelli adeguati.
Scopo dello studio
- Stabilire un metodo di coltura affidabile per cellule hfRPE.
- Creare un modello per lo studio delle malattie oculari umane.
- Facilitare studi in vitro e preclinici sulla funzione e patologia dell'epitelio pigmentato retinico (RPE).
Metodi Utilizzati
- Dissezione di bulbi oculari umani per isolare le cellule dell'epitelio pigmentato della retina (RPE).
- Coltura delle cellule RPE per formare monolayer confluenti.
- Utilizzo di esperimenti funzionali in vitro per valutare la fisiologia delle cellule RPE.
- Sperimentazioni precliniche in modelli animali per valutare le risposte delle cellule RPE.
Risultati principali
- Coltivato con successo cellule hfRPE che mostrano caratteristiche simili a quelle adulte.
- Dimostrato il potenziale di queste colture per l'uso nella modellizzazione delle malattie.
- Fornito informazioni sulle funzioni delle cellule RPE e sui percorsi di segnalazione.
- Stabilita una base per future ricerche terapeutiche mirate alle malattie oculari.
Conclusioni
- Il metodo descritto consente lo studio efficace della fisiologia dell'epitelio pigmentato retinico (RPE).
- Queste colture possono migliorare la comprensione delle malattie retiniche.
- La ricerca futura potrà basarsi su questo modello per sviluppare nuovi trattamenti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Modelli in vitro robusti di epitelio pigmentato retinico umano (RPE) sono essenziali per ridurre i rischi nelle fasi iniziali della scoperta di farmaci oftalmici e per consentire una valutazione predittiva delle ipotesi terapeutiche. Il sistema di coltura primario di hfRPE descritto fornisce una piattaforma fisiologicamente rilevante per lo studio della funzione dell'RPE, dei meccanismi patologici e delle strategie di intervento prima di intraprendere studi sugli animali. Questa capacità supporta la continuità traslazionale e il triage del portafoglio nei processi di sviluppo di farmaci per l'occhio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi meccanicistica di vie specifiche dell'epitelio pigmentato retinico coinvolte nelle malattie retiniche.
- Supporta la validazione funzionale degli obiettivi riproducendo la polarità nativa dell'epitelio pigmentato retinico e l'attività di trasporto.
- Facilita la riduzione del rischio biologico prima di passare ai modelli animali.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una fonte riproducibile e scalabile di monocapati di RPE umano per saggi quantitativi in vitro.
- Permette la standardizzazione di letture funzionali e genetiche rilevanti per la salute retinica.
- Supporta lo sviluppo di saggi per lo screening di composti mirati a processi mediati dal RPE.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Collega i risultati ottenuti in vitro ai modelli animali preclinici per studi di intervento terapeutico.
- Correla i fenotipi cellulari rilevanti per la malattia con strategie traslazionali di biomarcatori.
- Migliora la capacità predittiva per lo sviluppo di candidati farmaci oculari.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di coltura primaria di hfRPE si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la verifica di ipotesi, lo sviluppo di saggi e la validazione traslazionale per programmi dedicati alle malattie retiniche.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi e la riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli correlati all'epitelio pigmentato della retina (RPE).
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi per la valutazione di composti in sistemi RPE.
- Analisi: Offre misurazioni morfologiche, fisiologiche e genetiche per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Garantisce continuità dalla validazione in vitro alla validazione in modelli animali negli studi sulle malattie oculari.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per esigenze diversificate di ricerca e screening focalizzate sull'RPE.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi retinici.
- Valore operativo: Consente flussi di lavoro standardizzati, riproducibili e scalabili per la coltura dell'epitelio pigmentato retinico (RPE).
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza nell'uso del capitale nei portafogli oftalmici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di programmi terapeutici oculari con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento di cellule primarie e nelle tecniche di coltura epiteliale.
- Richiede l'accesso a infrastrutture specializzate per dissezione, coltura e analisi mediante imaging.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per saggi funzionali e genetici.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse fonti di donatori o modelli di malattia.
- Dipende dalla disponibilità di tessuto fetale umano e dal rispetto delle linee guida etiche.
