Perché l'isolamento di cellule positive al CD133 è importante per la validazione dell'obiettivo nel melanoma?

L'isolamento di cellule positive per CD133 consente la valutazione funzionale delle capacità tumorigeniche e di autorenovamento, fondamentali per convalidare bersagli di cellule staminali tumorali nel melanoma. Questa purificazione riduce il rumore derivante dalle cellule non staminali, aumentando l'affidabilità dei saggi di dipendenza dal bersaglio. Il metodo supporta la riduzione del rischio meccanicistico collegando l'espressione di CD133 al potenziale di iniziazione tumorale.

In che modo l'ordinamento cellulare attivato magneticamente consente l'isolamento di variabili indipendenti nella ricerca sulle cellule staminali?

La selezione cellulare attivata magneticamente isola frazioni positive e negative per CD133 etichettando solo la popolazione bersaglio con anticorpi biotinilati e microperle, creando gruppi sperimentali definiti. Questa isolazione della variabile indipendente (stato di CD133) consente ai ricercatori di attribuire differenze funzionali specificamente all'arricchimento delle cellule staminali. La tecnica garantisce che i fenotipi osservati nei saggi siano associati alla variabile isolata piuttosto che a popolazioni miste.

Quali misurazioni quantitative della variabile dipendente sono rese possibili dall'isolamento delle frazioni di melanoma definite da CD133?

Le frazioni isolate permettono misurazioni quantitative come l'efficienza di formazione di sfere, la frequenza di iniziazione tumorale in vivo e i tassi differenziali di risposta ai farmaci. Queste variabili dipendenti forniscono letture numeriche per confrontare i fenotipi associati alla stemness tra cellule CD133-positive e negative. Il metodo consente l'analisi statistica della frequenza delle cellule staminali e della loro potenza funzionale in diverse condizioni sperimentali.

Perché i requisiti di replicazione sono importanti per l'isolamento di cellule del melanoma CD133-positive e negative affidabili?

La replicazione garantisce che l'isolamento produca frazioni definite da CD133 con purezza e vitalità costanti tra esperimenti, elemento essenziale per saggi funzionali riproducibili. Una variabilità nell'efficienza di separazione potrebbe alterare il confronto tra popolazioni staminali e non staminali, compromettendo gli sforzi di validazione dei bersagli. Protocolli standardizzati con prove replicate aiutano a stabilire soglie robuste per purezza e recupero in contesti industriali.

Quali capacità di analisi statistica sono necessarie prima di implementare l'isolamento di CD133 nei protocolli per le cellule staminali del melanoma?

L'implementazione richiede la capacità di quantificare purezza e resa mediante citometria a flusso o metodi simili per valutare l'efficienza di separazione. Il confronto statistico di saggi funzionali (ad esempio, formazione di tumori, proliferazione) tra frazioni isolate richiede strumenti per il calcolo della significatività e dell'entità dell'effetto. L'accesso a software per l'analisi di dati replicati garantisce che le differenze osservate nei fenotipi delle cellule staminali siano statisticamente valide e non dovute alla variabilità dell'isolamento.

Isolamento delle cellule staminali del melanoma: un metodo per ottenere cellule di melanoma CD133 positive e negative utilizzando la selezione cellulare attivata magneticamente

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

0 visualizzazioni • 5:40 min • April 30th, 2023

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- Il melanoma ospita una piccola sottopopolazione di cellule staminali tumorali che possiedono sia capacità di autorinnovamento che di iniziazione del tumore. CD133 o Prominin-1, una glicoproteina transmembrana pentaspan, è uno dei marcatori chiave espressi dalle cellule staminali tumorali del melanoma metastatico. Per isolare le cellule CD133-positive, iniziare con una sospensione di cellule primarie di melanoma in un tampone appropriato.

Incubare con un reagente bloccante contenente proteine che bloccano i siti di legame non specifici sulla superficie cellulare. Trattare le cellule con anticorpi primari CD133 biotinilati. Questi anticorpi si legano agli antigeni CD133 espressi sulle cellule CD133-positive. Ora, aggiungi microsfere magnetiche anti-biotina alla sospensione. Incubare per far sì che le microsfere si leghino alle cellule marcate con biotina.

Infine, far passare la sospensione incubata attraverso una colonna posta in un campo magnetico. Con l'influenza magnetica, tutte le cellule CD133-positive marcate con le microsfere si attaccano alla colonna, mentre le cellule non marcate vi passano attraverso. Raccogli queste cellule CD133-negative non marcate. Rimuovere la colonna dal campo magnetico. Lavare il contenuto utilizzando un tampone adatto per eluire e raccogliere le cellule CD133-positive.

Nel seguente protocollo, mostreremo l'isolamento di cellule staminali tumorali CD133-positive e negative da una coltura di melanoma primario ottenuto da tessuto tumorale. Lavare l'80% delle celle confluenti con PBS preriscaldato. Aggiungere una quantità appropriata di Accutase e incubare fino a quando le cellule non si staccano dalla superficie di coltura. Raccogliere le cellule nel terreno Quantum 263 e trasferirle in una provetta da 50 millilitri.

Enumera le celle. Quindi, centrifugare il numero richiesto di celle per 5 minuti a 300 x g e da 4 a 8 gradi Celsius. Aspirare completamente il surnatante e risospendere fino a 1 volte 10 all'ottava cella in un tampone MACS da 350 microlitri. Aggiungere 100 microlitri di reagente bloccante FcR e 50 microlitri di CD133/1-biotina. Mescolare bene e incubare a 4 gradi Celsius per 10 minuti.

Lavare le celle con 10 millilitri di tampone MACS, seguito da centrifugazione per 5 minuti a 300 x g e da 4 a 8 gradi Celsius. Aspirare completamente il surnatante. Dopo un secondo lavaggio, risospendere il pellet cellulare in 400 microlitri di tampone MACS. Aggiungere 100 microsfere anti-biotina da 100 microlitri e mescolare bene. Incubare a 4-8 gradi Celsius per 15 minuti.

Nel frattempo, per preparare il separatore MACS per la separazione magnetica, collegare il QuadroMACS al MACS Separator Multi Stand. Inserire il numero richiesto di colonne LS con le ali della colonna in avanti nel campo magnetico del QuadroMACS. Posizionare un filtro di pre-separazione in ciascuna colonna LS e una provetta di raccolta appropriata sotto ciascuna colonna.

Sciacquare il filtro e la colonna con 3 millilitri di tampone MACS ed eliminare il flusso. Dopo aver lavato le cellule nel tampone MACS come descritto in precedenza, risospendere le cellule in un tampone MACS da 500 microlitri e applicare la sospensione cellulare sulla colonna LS preparata. Lavare tre volte con 3 millilitri di tampone MACS per colonna. Raccogliere l'effluente totale della frazione cellulare CD133-negativa non marcata.

Quindi, gettare il filtro di pre-separazione, rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla su un tubo di raccolta adatto. Applicare 5 millilitri di tampone MACS. Eliminare immediatamente le cellule CD133-positive marcate spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna. Per aumentare la purezza della frazione negativa, applicare la sospensione cellulare su una nuova colonna LS bilanciata e raccogliere la frazione CD133-negativa dell'effluente.